YY1誘導lncRNADUXAP9對阻斷CDK1介導EZH2降解驅動口腔鱗狀細胞癌
2023年7月3日,上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院曹巍教授團隊和上海交通大學醫(yī)學院趙旭赟研究員課題組合作在Advanced Science (IF=15.1) 在線發(fā)表了題為“Yin Yang 1-Induced Long Noncoding RNA DUXAP9 Drives the Progression of Oral Squamous Cell Carcinoma by Blocking CDK1-Mediated EZH2 Degradation”的研究論文。該研究報道了一個新的在口腔鱗狀細胞癌中高表達的lncRNA——DUXAP9,并通過一系列研究揭示了DUXAP9在翻譯后水平誘導EZH2表達的新機制,從而驅動口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生和發(fā)展,為口腔鱗狀細胞癌治療提供了新的潛在靶點。
發(fā)表期刊:Advanced Science
影響因子:15.1
涉及的服務產品:affymetrix OE lncRNA芯片
口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是一種具有侵襲性表型的高異質性腫瘤。近年來研究發(fā)現lncRNAs在OSCC的進展中起著關鍵作用。然而,大多數lncRNAs在OSCC中的功能和詳細的分子機制尚不完全清楚。EZH2是PRC2的催化亞基,是一種高度保守的組蛋白甲基轉移酶,是基因轉錄調控的抑制因子。之前的研究表明EZH2是OSCC患者一個獨立的預后指標。然而,lncRNA翻譯后調控EZH2在OSCC進展中的潛在機制仍有待全面闡明和進一步研究。
本研究發(fā)現了一個新的lncRNA——DUXAP9,它在OSCC組織中顯著上調,并且與OSCC患者的生存率密切相關。而Yin Yang 1 (YY1)可激活DUXAP9在OSCC中的轉錄表達。并且DUXAP9通過抑制EZH2磷酸化而抑制EZH2降解,從而阻斷EZH2從細胞核向細胞質的轉位。
Result1? DUXAP9是一種在OSCC中高表達的核定位lncRNA,與患者不良的臨床病理特征相關
為了確定OSCC中顯著上調的lncRNAs,首先在5對OSCC和相應的鄰近正常組織中進行l(wèi)ncRNA芯片檢測,結果顯示DUXAP9在OSCC中顯著高表達,經預測發(fā)現其缺乏編碼能力。為了驗證DUXAP9在癌癥中的表達,使用TCGA數據庫進行了泛癌分析,發(fā)現DUXAP9在5個OSCC細胞系中表達上調。RNAscope檢測也顯示DUXAP9在OSCC腫瘤組織中富集。qRT-PCR檢測了90個配對的OSCC樣本及鄰近正常組織,DUXAP9在OSCC組織中的表達高于鄰近正常組織。這些結果表明,DUXAP9可能在OSCC的發(fā)生發(fā)展中起致癌作用。
接著研究了DUXAP9在口腔鱗癌中的臨床相關性, 其顯著高表達與病理分化差、臨床晚期、淋巴結轉移、差的總生存率和疾病特異性生存率相關。同時,對DUXAP9進行亞細胞定位研究,結果表明DUXAP9主要在細胞核中表達,提示DUXAP9可能在細胞核內發(fā)揮其生物學功能。
圖1.DUXAP9是一種核lncRNA,在OSCC患者中高表達,與臨床病理特征呈正相關
Result2 DUXAP9促進OSCC細胞增殖、侵襲和轉移
實驗結果顯示,體外敲低DUXAP9基因可抑制OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲;上皮-間質轉化(EMT)標志物N-cadherin、Vimentin、TWIST、SNAIL和SLUG在DUXAP9敲低后減少,Ecadherin增加。而過表達DUXAP9則產生了與上述相反的結果。
接下來檢測了DUXAP9在體內調控腫瘤發(fā)生中的表達。與對照組相比,DUXAP9敲低組的小鼠腫瘤體積和重量明顯減少,腫瘤的Ki67、PCNA和EZH2染色較弱。而過表達DUXAP9后觀察到了相反的結果。這些結果進一步證實了DUXAP9在促進腫瘤形成中的關鍵作用。并探究了DUXAP9是否影響OSCC細胞的轉移,觀察到DUXAP9過表達的報告細胞比載體對照細胞更多地轉移到裸鼠的肺部并且在肺部形成更多的腫瘤結節(jié)。
圖2.敲低DUXAP9基因抑制OSCC細胞的生長、遷移和侵襲
圖3.DUXAP9過表達可促進OSCC細胞的體外生長、遷移和侵襲
圖4.DUXAP9促進OSCC細胞癌移植瘤生長和轉移
Result3 YY1能夠激活OSCC細胞中DUXAP9轉錄表達
為了尋找在OSCC中可能調節(jié)DUXAP9上調的轉錄因子。使用數據庫預測結合DUXAP9啟動子區(qū)域的TF,發(fā)現了兩個轉錄因子RXRA和YY1。并進一步發(fā)現只有YY1與DUXAP9具有顯著的表達正相關。敲低OSCC細胞中YY1基因抑制了DUXAP9的表達;而過表達YY1則有相反的結果。
進行染色質免疫沉淀(ChIP)和熒光素酶分析驗證YY1與DUXAP9啟動子的結合位點,結果表明,YY1高度富含在DUXAP9啟動子區(qū)域的?90-100bp區(qū)域。并且在OSCC細胞中,YY1結合基序相鄰的pgl3-P2熒光素酶報告被顯著激活;DUXAP9啟動子8~23bpMotif2突變的熒光素酶活性明顯低于對照。
此外,還研究了YY1在OSCC中的臨床相關性。YY1在OSCC中的表達高于癌旁正常組織,并且其顯著高表達與臨床晚期、淋巴結轉移相關。綜上結果表明YY1在轉錄水平上調節(jié)OSCC細胞DUXAP9的表達。
圖5.YY1轉錄激活DUXAP9表達
Result4 DUXAP9與EZH2的直接相互作用
接下來探討DUXAP9調控口腔鱗癌發(fā)生的機制。在OSCC細胞中鑒定到32個蛋白質定位于核質中,是DUXAP9結合的候選者。之前的靶向藥物篩選發(fā)現EZH2是口腔鱗癌進展的關鍵調節(jié)因子。通過RIP-qPCR以及RNA pull-down證實了DUXAP9物理上與EZH2結合。共聚焦顯微鏡顯示DUXAP9和EZH2在OSCC癌細胞核內共存,并且DUXAP9具有很高的蛋白質-RNA相互作用傾向。利用重組EZH2蛋白和體外轉錄的野生型和突變型DUXAP9 RNA進行的體外重組RIP實驗進一步證實了DUXAP9與EZH2的直接相互作用,表明DUXAP9堿基對1114-1165nt上的核苷酸可能是EZH2的主要結合部位。
圖6.OSCC細胞中DUXAP9和EZH2的物理相互作用
Result5 DUXAP9通過抑制蛋白酶體介導的降解提高EZH2蛋白的穩(wěn)定性
下面研究DUXAP9是否調節(jié)EZH2的表達水平,結果發(fā)現DUXAP9正向調節(jié)EZH2的蛋白水平,但不能調節(jié)EZH2的mRNA水平,表明DUXAP9可能在翻譯后調節(jié)OSCC細胞中EZH2的表達。接著進一步闡明DUXAP9上調翻譯后EZH2表達的機制,發(fā)現DUXAP9的表達促進了EZH2的穩(wěn)定性。在OSCC細胞中,用蛋白酶體抑制劑MG132處理后,由于SS-DUXAP9轉導而導致的EZH2表達下降完全被挽救。而MG132在對照細胞中增加了EZH2的表達,但在DUXAP9過表達的細胞中沒有增加。表明DUXAP9通過抑制蛋白酶體的降解來增加EZH2蛋白的表達。EZH2的免疫沉淀和抗泛素免疫印跡表明,在SS-DUXAP9過表達的細胞中,泛素化的EZH2顯著增加,而在DUXAP9過表達的細胞中,EZH2泛素化顯著降低。因此,DUXAP9抑制OSCC細胞中EZH2的泛素化和蛋白酶體降解,并導致EZH2表達上調。
圖7.DUXAP9通過抑制蛋白酶體降解促進EZH2蛋白表達
Result6 DUXAP9通過抑制EZH2的磷酸化和核質轉位抑制EZH2的降解
據報道,CDK1介導的EZH2在Thr345和Thr487處的磷酸化是泛素化和隨后通過泛素-蛋白酶體途徑降解所必需的。后續(xù)實驗證實了在CDK1過表達的細胞中,磷酸化的EZH2(Thr345/487)和泛素化的EZH2升高。對DUXAP9進行敲低和過表達;發(fā)現在OSCC細胞中,敲低DUXAP9顯著增加了Thr345/487磷酸化的EZH2,而過表達DUXAP9則相反。同時DUXAP9的過表達顯著抑制了EZH2和CDK1之間的相互作用。隨后等一系列結果表明,DUXAP9通過抑制CDK1介導的EZH2的磷酸化和泛素化,阻斷EZH2從細胞核向細胞質的易位,從而抑制EZH2的降解。
圖8.DUXAP9通過抑制EZH2的磷酸化抑制EZH2的降解
圖9.DUXAP9通過核質易位抑制EZH2降解
Result7 DUXAP9以EZH2依賴的方式促進OSCC細胞的增殖和侵襲
接下來確定DUXAP9是否通過調節(jié)EZH2的表達和EZH2相關的PRC2復合體活性來促進OSCC的發(fā)展。qRT-PCR結果表明,在EZH2過表達和DUXAP9過表達的細胞中,9個已知的EZH2靶基因的表達均降低,提示DUXAP9通過EZH2的表達發(fā)揮作用。進一步發(fā)現DUXAP9可能通過調節(jié)PRC2復合體活性來調控EZH2靶基因。實驗結果發(fā)現,敲低DUXAP9減少了EZH2與其靶基因的結合,這表明在敲低DUXAP9細胞中,PRC2復雜功能受到了損害。敲低EZH2顯著減少了由過表達DUXAP9的OSCC細胞形成的腫瘤的體積和重量,并降低了Ki67、增殖細胞核抗原和EZH2蛋白的表達水平。這些結果顯示了DUXAP9以EZH2依賴的方式誘導OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲。
圖10.DUXAP9通過介導EZH2的表達和功能促進OSCC細胞的增殖和侵襲
本研究發(fā)現了一個新的在OSCC中高表達的核定位lncRNA——DUXAP9,在體內外促進OSCC細胞的增殖、侵襲和轉移。DUXAP9被YY1轉錄激活,并通過直接與EZH2結合來抑制CDK1介導的EZH2在T345和T487的磷酸化和泛素化,從而抑制其蛋白酶體降解的核質轉位??傊沂玖薉UXAP在翻譯后水平誘導EZH2表達的新機制,從而驅動OSCC的發(fā)生和進展,提示DUXAP9可能是OSCC治療的潛在靶點。
圖11.YY1誘導的DUXAP9通過阻斷CDK1介導的EZH2降解來驅動OSCC
參考文獻
Zhou W, Feng Y, Lin C, Chao CK, He Z, Zhao S, Xue J, Zhao XY, Cao W. Yin Yang 1-Induced Long Noncoding RNA DUXAP9 Drives the Progression of Oral Squamous Cell Carcinoma by Blocking CDK1-Mediated EZH2 Degradation. Adv Sci (Weinh). 2023 Jul 3:e2207549. doi: 10.1002/advs.202207549.
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排版人:七七
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