心動過緩是常見的心血管疾病之一，臨床上有效的口服藥物很少見。參仙升脈（SXSM）是經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局許可的一種中藥。但其改善人iPSC-CMs（心肌細(xì)胞）搏動的胞內(nèi)分子機(jī)制并不清晰。

2023年5月，來自復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院&上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院的李華研究團(tuán)隊(duì)在Clinical and Translational Medicine（IF=10.6）上發(fā)表題為“Transcriptomics, proteomics, metabolomics and network pharmacology reveal molecular mechanisms of multi-targets effects of Shenxianshengmai improving human iPSC-CMs beating”的研究文章。該研究主要通過中藥成分解析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組的多組學(xué)聯(lián)合整合分析來揭示參仙升脈通過多重靶向作用改善人源iPSC-CMs搏動的分子機(jī)制。中科新生命為其提供了轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組的多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)服務(wù)。

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研究材料

人源iPSC-CMs細(xì)胞

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?實(shí)驗(yàn)路線圖?

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研究結(jié)果

1. 中藥成分組分析

基于UPLC-QTOF-MS/MS和GC–MS與標(biāo)準(zhǔn)中藥化學(xué)品進(jìn)行比較，對SXSM的單體成分進(jìn)行鑒定，去除重復(fù)和異構(gòu)體后，共鑒定出262種候選化合物，列出了一些具有代表性單體組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

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圖1 參仙升脈單體成分鑒定

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2. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

基于STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了化合物和疾病潛在靶標(biāo)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，得到了150個核心靶標(biāo)。作者將上述核心靶標(biāo)進(jìn)行了GO和KEGG通路富集分析，GO結(jié)果表明SXSM可能增加細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝環(huán)境。KEGG結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑顯著富集。

表1 150個核心靶標(biāo)列表

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3. 轉(zhuǎn)錄組，蛋白組，代謝組多組學(xué)分子機(jī)制研究

經(jīng)過藥物濃度梯度篩選，最終確定用0.55mg/ml 的SXSM處理人源iPSC-CM細(xì)胞1h后收集細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組，蛋白組和代謝組分析。

轉(zhuǎn)錄組：共篩選到345個差異基因（DEG）。基于GO數(shù)據(jù)庫的GSEA通路富集分析，發(fā)現(xiàn)三種鈣相關(guān)途徑的活性增加，也證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中所示的能量代謝的動員作用，并與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中顯示的抗凋亡作用一致，心肌細(xì)胞凋亡途徑受到抑制；而基于KEGG數(shù)據(jù)庫的GSEA分析發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝具有顯著下調(diào)趨勢。另外，檢測到一些顯著差異的可變剪接（AS）事件。隨后，對從五種AS形式中獲得的基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果表明與剪接體、心率升高、能量、鈣、磷酸化和抗細(xì)胞凋亡直接相關(guān)。

蛋白質(zhì)組：共鑒定到190種差異蛋白。KEGG富集分析結(jié)果顯示：1）SXSM給藥導(dǎo)致人源iPSC-CMs的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)穩(wěn)定，興奮性收縮偶聯(lián)增強(qiáng)；2）SXSM給藥主要基于氧化磷酸化和TCA循環(huán)實(shí)現(xiàn)在人源iPSC-CMs上的能量動員；3）剪接體途徑（ko03040）在轉(zhuǎn)錄組AS（A5SS，RI）和蛋白質(zhì)組中均富集。SF3B1在轉(zhuǎn)錄組AS中檢測到，并在蛋白質(zhì)組中升高，它有助于心肌細(xì)胞的能量代謝從脂肪酸代謝（FAO）向糖酵解轉(zhuǎn)變。

代謝組：共檢測到138種顯著差異代謝物（pos 110，neg 68），并基于KEGG和SMPDB進(jìn)行了富集分析。結(jié)果顯示抗衰老和抗細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑，以及TCA循環(huán)和能量代謝相關(guān)的途徑顯著富集。

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圖2 CTRL vs SXSM的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析

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4. 組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合分析

作者進(jìn)一步對三種組學(xué)進(jìn)行了聯(lián)合分析，以闡明分子途徑。在“基因-蛋白質(zhì)-代謝物”維度上進(jìn)行了二對二分析：即AS事件和蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)-代謝物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)以及DEG和差異代謝物的O2PLS分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

1）天冬氨酸在代謝組中減少，表明人源iPSC-CMs采用預(yù)先儲存的氨基酸來發(fā)電，而蛋白組也進(jìn)一步解釋了天冬氨酸的減少，即其進(jìn)入TCA循環(huán)以供能。

2）半乳糖代謝中的代謝物（蔗糖、肌醇半乳糖苷、半乳糖醇、蜜二糖）被下調(diào)，表明SXSM抑制了半乳糖代謝途徑，從而延緩了人源iPSC- CMs的功能障礙。

3）谷氨酰胺在代謝組中增加。此外，谷氨酰胺代謝相關(guān)蛋白SLC1A5、GLS、GLUD1、GCLM、SHMT2和GSS增加，進(jìn)一步解釋谷氨酰胺代謝可能具有心臟保護(hù)作用。

4）SXSM抗凋亡的其他途徑：鞘脂代謝中減少的植物鞘氨醇和鞘氨醇可以阻止mPTP開放，限制線粒體的促凋亡細(xì)胞色素C泄漏，保護(hù)心肌能量代謝。

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圖3?三組學(xué)聯(lián)合分析

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5. 機(jī)制驗(yàn)證

最后，通過添加KN93（CaM/CaMKII抑制劑）、AIP（CaMKII的選擇性抑制劑）、Na+/Ca2+交換劑選擇性抑制劑等進(jìn)行SXSM增強(qiáng)人源iPSC-CMs搏動的多通道驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.55mg/mL SXSM治療主要觸發(fā)Ca2+-CaM-AC-PKA途徑（一種激活鈣庫的途徑）。

圖4?SXSM對人iPSC-CMs鈣相關(guān)信號通路的驗(yàn)證
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小編小結(jié)

本文分享了中藥藥效功能機(jī)制研究的完整思路--首先通過中藥成分分析確定活性成分，再網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測藥物成分的作用靶點(diǎn)及通路，然后又基于轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組進(jìn)一步對預(yù)測的功能通路進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充，最終鎖定關(guān)鍵的通路，即SXSM增加人源iPSC-CMs的細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)和細(xì)胞內(nèi)鈣，并加速興奮性收縮偶聯(lián)，同時，SXSM通過充分調(diào)動糖酵解途徑、氨基酸代謝和脂肪酸β-氧化來促進(jìn)TCA循環(huán)和氧化磷酸化，從而更好地為人源iPSC-CMs供能。本研究可能為無法植入起搏器的心律失?；颊咛峁┨娲委熯x擇。

【中科新生命】以蛋白質(zhì)組、修飾組、代謝及脂質(zhì)組等質(zhì)譜服務(wù)為核心，并延伸打造微生物、轉(zhuǎn)錄組、時空多組學(xué)服務(wù)，創(chuàng)建了中藥研究與轉(zhuǎn)化創(chuàng)新平臺，為您的研究保駕護(hù)航！歡迎感興趣的老師前來咨詢。