研究背景

由于將形態(tài)學和免疫表型結(jié)合可以提高診斷能力，因此建立一種形態(tài)計量學的方法，使細胞檢測流程中能間接看到顯微鏡下的特征變化是十分有必要的。隨著疾病和樣本類型特定的分析方法需要，需要一種可自動化的方法。像質(zhì)譜流式細胞術(shù)（CyTOF）的方法，因為有高度復(fù)用性和定量動態(tài)范圍廣的特點，有望滿足需求。

質(zhì)譜儀可使用重金屬同位素偶聯(lián)物取代熒光基團，在單個細胞上同時量化40多種抗原，在一天內(nèi)可實現(xiàn)對數(shù)百萬個細胞的量化，同時實現(xiàn)系統(tǒng)化和自動化的分析。樣本復(fù)用——可同時處理和運行多個樣本，允許分批進行，這樣也可以降低成本。

本研究確定了一組細胞抗原，對來自健康人骨髓的細胞進行了表征研究，與來自不同疾病的骨髓和血液樣本的細胞進行比對，通過單細胞形態(tài)測量定義了正常和腫瘤群體。這些工作能夠追蹤健康和惡性造血分化的連續(xù)過程，形成靶向細胞計數(shù)的基礎(chǔ)，或可應(yīng)用于當前的臨床實驗室流程中。

研究思路

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研究結(jié)果

1、散射體量化了造血細胞的不同結(jié)構(gòu)特征

為了通過形態(tài)計量學捕捉光學顯微鏡評估的細胞形態(tài)，研究人員分析了人造血細胞共有的多種類型，選擇了11個形態(tài)計量學指標(圖1A-B)，這些結(jié)構(gòu)特征在與診斷相關(guān)的造血細胞群體-粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、有核紅系前體細胞和造血母細胞(圖1D)之間存在定量差異。這些特征的復(fù)合單細胞分析通過計算能把結(jié)果組合為二維的“形態(tài)測量圖”(圖1E)。質(zhì)譜流式CyTOF單細胞蛋白質(zhì)組學將揭示其免疫細胞類型組成和異常細胞類型(圖1F)，將形態(tài)計量學與標準免疫表型表征相結(jié)合。僅使用形態(tài)測量法和CD45，t-SNE能成功地分離形態(tài)不同的種群。重要的是，沒有分離形態(tài)上沒區(qū)別的B細胞和T細胞。因此，形態(tài)計量學分析定量捕獲足夠形態(tài)特征對主要細胞類型進行分類。

圖1 | 散射體捕捉了健康人骨髓中主要造血細胞群體的形態(tài)差異

2、不同臨床患者樣本單細胞形態(tài)學特征具有相似性

研究者選擇了54個不同血液系統(tǒng)腫瘤的臨床樣本，包括AML、ALL、MDS、MPN、B和T細胞，使用CD抗體定義這些樣本群體，比較它們的形態(tài)特征，正常細胞的形態(tài)學特征具有高度一致性。為了說明腫瘤多樣性和潛在的形態(tài)學原理，選擇了11個樣本進行熱圖分析（圖2A-G）。研究表明來自淋巴白血病的原始細胞顯示出更多的淋巴細胞模式，而來自髓性白血病的原始細胞則顯示出更多的骨髓特征（圖2D）。

為定量地驗證這些模式，對患者細胞群之間形態(tài)學特征進行了相關(guān)性分析，并進行層次聚類（圖2H）。研究發(fā)現(xiàn)來自不同患者的相同細胞類型的形態(tài)學特征高度相關(guān)。但其CD抗體表達差異很大?？傮w來說，即使在疾病樣本中，形態(tài)計量學也可以識別出細胞類型特異性標志物。

圖2 | 不同臨床患者樣本的形態(tài)特征具有一致性

3、個體形態(tài)特征具有獨特的診斷能力

評估了主要細胞類型的整體形態(tài)測量后，各形態(tài)顯示出對診斷有用的特征。該研究發(fā)現(xiàn)對正常/反應(yīng)性外周血，骨髓和淋巴結(jié)T細胞表達一種核纖層蛋白A/C，研究人員推測腫瘤群可能表現(xiàn)出更多的核纖層蛋白A/C。在進一步研究中5種成熟T細胞淋巴瘤均表達核纖層蛋白A/C，且與T-ALL原始細胞和正常T細胞相比，核纖層蛋白A/C高表達（圖3A-B）。研究表明，核纖層蛋白A/C也有助于區(qū)分標準臨床流式細胞術(shù)無法區(qū)分的T未成熟淋巴細胞白血病(T-PLL)和T淋巴細胞白血病(T-ALL)。

臨床研究上多以CD34和CD117標記鑒定腫瘤母細胞，但兩者也在肥大細胞、紅系和血小板前體細胞上表達。因此這兩種標記不適用于所有白血病的檢測（圖3D）。研究人員尋找一個與大多數(shù)原始細胞所具有的形態(tài)上“精細”的核染色質(zhì)相關(guān)的標記物——在39個樣本中，正常和腫瘤原始細胞始終高表達的核纖層蛋白B1(圖3E)。鑒于白血病的免疫表型和譜系的多樣性，這種單細胞形態(tài)計量學方法結(jié)合核纖層蛋白B1的定量，代表了迄今為止最一致的原始細胞識別符。此外研究中發(fā)現(xiàn)rRNA的丟失或許可作為一個單一抗原的“偽時間”軸，能夠跟蹤細胞沿多個譜系的發(fā)展。結(jié)合VAMP-7，能在健康的骨髓樣本中觀察原始細胞向髓系和淋巴樣細胞的演變(圖3F)。以上說明了形態(tài)計量學可以提供對多個細胞譜系的診斷。

4、VAMP-7是在未知血液系統(tǒng)惡性腫瘤分類的替代方法

SSC（側(cè)向散射）主要來源于光對細胞內(nèi)顆粒的垂直反射，VAMP-7是主要功能成分。在最初研究的54個臨床樣本中，分析發(fā)現(xiàn)VAMP-7與CD45的關(guān)系和SSC與CD45的關(guān)系高度相似（圖3G-H）。因此對它是否可以成為非熒光細胞術(shù)診斷工作流程的有效替代方案存疑。為了證明這點，研究人員選擇了11個樣本進行了相似的處理。研究發(fā)現(xiàn)在流式細胞術(shù)和質(zhì)譜流式單細胞蛋白質(zhì)組學在診斷上是等效的——即捕獲了相同的亞群，免疫表型特征相似，可用于相同的疾病診斷。且流式細胞術(shù)和形態(tài)計量細胞學的結(jié)果高度相關(guān)（R2=0.84，p<10-190）。因此，VAMP-7可以作為SSC的替代物用于大規(guī)模細胞計數(shù)中。

圖3 | FRA 對膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和 JNK/p53 通路成分表達水平的影響

5、用于最佳種群識別的多參數(shù)形態(tài)測量圖

雖然VAMP-7可以概括SSC用于實驗室診斷，但研究人員想要生成新的二維可視化圖來整合細胞形態(tài)測量的多個維度。為了確定SSC與CD45或VAMP-7與CD45的關(guān)系，研究人員用線性判別分析（LDA）生成形態(tài)測量圖（圖4A-B）。將形態(tài)計量圖(MM)的群體、SSC與CD45、VAMP-7與CD45的群體進行比較。研究發(fā)現(xiàn)MM門控在四個人群中表現(xiàn)與SSC和VAMP-7的更相似，純度更高，特別是胚胎細胞和單核細胞（圖4C-E）。證實了將來自多個單細胞結(jié)構(gòu)特征的信息組合到新的形態(tài)測量軸上的方法改進了傳統(tǒng)的基于光散射的形態(tài)評估。

圖4 | 形態(tài)測量圖對SSC與CD45門控進行改進

6、對比正常的粒細胞和骨髓發(fā)育不良的髓系形態(tài)計量圖

形態(tài)計量學線性判別分析（LDA）也適合連續(xù)的分化過程。研究人員從健康對照樣本中分離單核細胞、原始細胞和成熟中性粒細胞的單細胞，建立了乳鐵蛋白、核纖層蛋白A/C、核纖層蛋白B1、溶菌酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑B1、VAMP-7和CD45髓系分化軸（圖5A），進一步確定髓系分化軸能否可視化分化過程。根據(jù)標記CD34、CD13、CD15和CD16進行了中性粒細胞分化的五種階段（原始細胞→早幼粒細胞→髓細胞→間髓細胞→中性粒細胞）在髓系分化軸上的定位（圖5B）。表明這種髓系分化軸無需使用表面標記就以可視化粒細胞。

7、用形態(tài)計量圖量化髓系白血病中成熟胚胎細胞

為標準化散射體染色變異性，研究人員訓練新的原始細胞分化軸，以最佳地分離三個健康骨髓樣本的單核細胞、中性粒細胞和原始細胞。在rRNA和BD2上繪制髓系細胞圖(圖5D)，模型圖左上角為原始細胞，向右下角成熟為中性粒細胞，向右方向成熟為單核細胞。研究發(fā)現(xiàn)正常單核細胞的rRNA水平與背景成熟的粒細胞相似或更低(圖5D，綠色箭頭)。此外，典型的白血病原始細胞向正常原始細胞的左上角移動(圖5D，AML 9)，而單核細胞原始細胞向右上移動(圖5D，AML 7)。研究進一步證明了如何使用有監(jiān)督的機器學習，針對特定的診斷問題定制多用途形態(tài)測量標記的新組合，并且優(yōu)于標準的免疫表型和光學顯微鏡技術(shù)，從而提高血液病的診斷能力。

圖5 | 與CD45相比，形態(tài)計量圖可以概括并改善側(cè)面散射

研究討論

在本研究結(jié)果中，研究人員研究了不同血液病腫瘤類型的臨床樣本，單細胞形態(tài)測量定義了正常和腫瘤群體。研究發(fā)現(xiàn)核纖層蛋白B1有助于區(qū)分急性白血病，核纖層蛋白A/C有助于區(qū)分正常和腫瘤的成熟T淋巴細胞，VAMP-7 概括了光細胞儀側(cè)向散射。結(jié)合有監(jiān)督的機器學習，形成了正常和腫瘤細胞分布和分化的直觀可視化，這種方法優(yōu)于流式細胞術(shù)和光學顯微鏡技術(shù)，能夠提高造血系統(tǒng)疾病診斷的自動化能力。

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