寫在前面

????????今天推薦的是由廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院及研究所在2019年4月30日發(fā)表于Cell Discovery（2020IF：10.850，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Jinbao Liu教授，研究表明USP10通過穩(wěn)定慢性粒細胞白血病中的SKP2來調(diào)節(jié)SKP2/Bcr-Abl軸。

研究背景

????????酪氨酸激酶Bcr-Abl的組成性激活是慢性粒細胞白血病 (CML) 發(fā)生和惡化的主要原因。目前，針對Bcr-Abl的酪氨酸激酶抑制劑 (TKI) 的應用是CML患者的主要治療方法。然而，在長期給藥過程中逐漸產(chǎn)生對TKI的獲得性耐藥性，使得TKI對晚期CML患者無效。因此，越來越多的研究集中在Bcr-Abl的擴增表達或激活上，這被認為有助于晚期階段的治療。

摘要部分

????????在這里，作者展示了S期激酶相關(guān)蛋白 2 (SKP2) 通過介導其K63連接的泛素化和激活作為Bcr-Abl的共同調(diào)節(jié)劑。進一步的研究表明，USP10作為SKP2的新型去泛素化酶通過介導CML細胞中SKP2的去泛素化和穩(wěn)定化來放大Bcr-Abl的激活。此外，USP10的抑制顯著抑制伊馬替尼敏感和伊馬替尼抗性CML細胞的增殖，且與SKP2狀態(tài)有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)在原代CML細胞中得到證實，因為這些細胞過表達USP10和SKP2，并且對USP10抑制劑敏感?？傊?，本研究不僅提供了對CML中Bcr-Abl放大激活的新機制，而且還表明靶向USP10/SKP2/Bcr-Abl軸是克服CML患者伊馬替尼耐藥的潛在策略。

研究內(nèi)容

1.SKP2與Bcr-Abl相互作用，是Bcr-Abl激活所必需的??? ? ?

????????以前的研究表明，SKP2是Bcr-Abl的下游，促進CML細胞增殖。IM對Bcr-Abl激酶的抑制導致SKP2表達的顯著降低和p27表達的增加。值得注意的是，與KBM5-T315I（突變）相比，KBM5細胞對IM處理更敏感，并且IM降低的Bcr-Abl和SKP2蛋白水平的磷酸化水平比KBM5-T315I細胞更顯著，表明SKP2的改變是與磷酸化Bcr-Abl的水平一致。作者探究Bcr-Abl是否反過來需要SKP2的生物活性。作者發(fā)現(xiàn)SKP2與IM敏感的KBM5和IM抗性KBM5-T315I細胞中的Bcr-Abl相互作用并能夠免疫共沉淀，并且這種相互作用不受IM的影響，表明這種相互作用與Bcr-Abl的磷酸化無關(guān)，SKP2可能在調(diào)節(jié)Bcr-Abl活性方面具有額外作用。? ? ?

????????為了進一步檢查SKP2在體內(nèi)對Bcr-Abl的影響，作者使用SKP2 shRNA或SKP2-C25測試了SKP2的遺傳或藥理學抑制對CML細胞中Bcr-Abl磷酸化和整體表達的影響。 SKP2的遺傳和藥理學抑制顯著降低了磷酸化Bcr-Abl及其下游信號的水平，包括磷酸化的 Crkl 和 STAT5，而總Bcr-Abl表達不受影響。此外，作者發(fā)現(xiàn)SKP2的抑制或喪失顯著抑制了所有 K562、KBM5和KBM5-T315I細胞的細胞活力，表明SKP2參與了Bcr-Abl的激活，而與T315I突變無關(guān)。

????????SKP2是E3連接酶之一，可以介導K48連接和K63連接的泛素化。由于抑制SKP2主要影響B(tài)cr-Abl的活性但不增加其蛋白質(zhì)水平，作者假設(shè)SKP2可能不會促進Bcr-Abl的蛋白水解降解，而是通過促進Bcr的K63連接的泛素化來增強Bcr-Abl的活性。實驗結(jié)果表明SKP2的遺傳或藥理學抑制降低了Bcr-Abl的K63連接但不是K48連接的泛素化。此外，SKP2的過表達增加了Bcr-Abl的K63連接的泛素化水平。因此，所有這些結(jié)果表明SKP2介導了Bcr-Abl的K63連接的泛素化，這是Bcr-Abl激活所必需的。

研究結(jié)論：SKP2不僅充當Bcr-Abl的下游調(diào)節(jié)劑，而且還是對Bcr-Abl信號傳導至關(guān)重要的協(xié)同調(diào)節(jié)劑。

?

2.USP10調(diào)節(jié)SKP2蛋白水平和Bcr-Abl激活? ? ?

????????為了找出是否有其他DUB可以調(diào)節(jié)SKP2，作者通過Co-IP測定篩選了內(nèi)源性SKP2與CML細胞中DUB之間的蛋白質(zhì)相互作用。作者發(fā)現(xiàn)SKP2與KBM5-T315I細胞中的USP10、USP13、UCHL5、USP14 和 USP7 相互作用。作者進一步檢測了敲低這些USP的HeLa細胞中SKP2的表達。只有USP10和USP13的敲低會降低SKP2的表達。發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性USP10在IM敏感KBM5和IM抗性KBM5-T315I細胞中結(jié)合SKP2。作者還在用 FLAG-USP10、FLAG-USP13 和 HASKP2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的 HEK293 細胞中使用Co-IP驗證了外源USP10和SKP2之間的相互作用。作者還發(fā)現(xiàn)USP10與SKP2的結(jié)合需要N端區(qū)域（1-205aa）。

????????作者進一步探討了USP10是否調(diào)節(jié)SKP2的表達。結(jié)果顯示USP10的過表達增加了HEK293T和HeLa細胞中SKP2的蛋白質(zhì)水平。為了探索USP10的去泛素化活性以富集SKP2，將野生型 (WT) 或催化失活突變體 (CA)USP10在HEK293T和HeLa細胞中表達。作者發(fā)現(xiàn)，只有USP10-WT增加了SKP2的蛋白質(zhì)水平，這表明SKP2富集需要USP10的去泛素化活性。此外，結(jié)果顯示USP10的缺失顯著降低了CML細胞中SKP2的表達，以及Bcr-Abl的磷酸化和下游信號，表明USP10是SKP2表達和Bcr-Abl磷酸化所必需的。作者進一步研究發(fā)現(xiàn)USP10的缺失抑制了CML細胞的增殖并誘導了G0/G1期停滯，表明USP10對CML細胞增殖至關(guān)重要。

????????此外，作者還評估了Spautin-1（一種USP10和USP13的選擇性抑制劑）對人CML細胞中Bcr-Abl-SKP2軸的影響。值得注意的是，Spautin-1顯著降低了SKP2的表達和Bcr-Abl的激活。此外，作者評估了Spautin-1對CML細胞的細胞周期進程或細胞死亡誘導的影響。結(jié)果顯示，Spautin-1使CML細胞明顯停滯在G0/G1期，但在K562、KBM5和KBM5-T315I細胞中沒有發(fā)生凋亡，表明Spautin-1在不同腫瘤中引發(fā)了細胞系依賴性事件。MTS結(jié)果還顯示，用Spautin-1對USP10進行藥理抑制后，CML細胞的活力明顯下降。這些數(shù)據(jù)共同表明，USP10通過靶向Bcr-Abl-SKP2-p27軸參與調(diào)控G1到S期轉(zhuǎn)換。

研究結(jié)論：USP10調(diào)節(jié)SKP2蛋白水平和Bcr-Abl激活。

?

3.USP10去泛素化并穩(wěn)定SKP2

????????作者探究了在抑制蛋白質(zhì)合成的放線菌酮 (CHX) 存在下USP10抑制對KBM5-T315I細胞內(nèi)源性SKP2蛋白質(zhì)水平的影響。使用Spautin-1對USP10的遺傳或藥理學抑制顯著降低了內(nèi)源性SKP2蛋白的穩(wěn)定性，表明USP10在體內(nèi)抑制了SKP2的降解。因此，作者研究USP10是否也作為SKP2的去泛素酶起作用。出乎意料的是，Spautin-1對USP10的藥理學抑制顯著增加了SKP2的多泛素化水平。此外，USP10通過其特定 shRNA的遺傳沉默也豐富了SKP2的多泛素化水平。為了找出USP10介導的SKP2去泛素化是否抑制其降解，作者探究了Spautin-1或USP10 shRNA對K48多泛素化SKP2豐度的影響。作者發(fā)現(xiàn)Spautin-1和USP10 shRNA都顯著增加了K48多泛素化SKP2的豐度。

研究結(jié)論：USP10可以作為SKP2的DUB，從而穩(wěn)定CML細胞中的SKP2。

?

4.USP10缺失對增殖的抑制取決于SKP2的功能狀態(tài)

????????為了進一步確定USP10功能對SKP2狀態(tài)的依賴性，作者接下來探究了在有無表達HA-SKP2質(zhì)粒的情況下穩(wěn)定表達對照 shRNA或 shUSP10的CML細胞中Bcr-Abl的激活。作者發(fā)現(xiàn)SKP2的過表達顯著恢復了Bcr-Abl的活性，使其免受 shUSP10的抑制。一致地，shUSP10抑制的CML細胞增殖被SKP2的過表達恢復。此外，引入 WT SKP2而不是無活性突變體SKP2(S72A)顯著恢復了K63相關(guān)泛素化的下調(diào)和由USP10抑制引起的Bcr-Abl失活，表明SKP2的S72對K63連接的泛素化和Bcr-Abl的激活。

研究結(jié)論：USP10的沉默或抑制可使Bcr-Abl失活并顯示SKP2依賴性抗CML作用。

?

5.USP10的缺失或抑制了體內(nèi)CML的生長

????????作者接下來探究USP10的缺失或抑制是否會抑制體內(nèi)CML異種移植物的生長。作者觀察到，USP10敲低組的腫瘤重量和體積顯著降低。同時，與載體組相比，USP10抑制組的腫瘤重量和體積，也顯著降低。Western blot顯示，與 Scramble異種移植物相比，穩(wěn)定表達USP10 shRNA的異種移植物中SKP2的表達和Bcr-Abl的激活顯著降低。此外，免疫染色結(jié)果證實，與Scramble組相比，穩(wěn)定表達USP10 shRNA的異種移植物中SKP2的表達和Bcr-Abl的激活顯著降低。

研究結(jié)論：USP10的藥理學或遺傳抑制對體內(nèi)CML治療有效。

?

6.USP10和SKP2在CML患者中上調(diào)

????????為了確定USP10調(diào)節(jié)SKP2的臨床相關(guān)性，作者對來自11名CML患者的原代單核細胞進行了USP10和SKP2的western blot分析。作者發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，CML患者的USP10和SKP2顯著上調(diào)。為了進一步確定USP10是否可以成為這些患者的藥物靶點，作者評估了Spautin-1對USP10的藥理學抑制對 16 名CML患者的原代單核細胞的體外抗腫瘤作用。值得注意的是，Spautin-1顯著降低了CML患者的原代單核細胞的細胞活力，其 IC50 值低于對照組。此外，用Spautin-1對USP10的藥理學抑制也顯著降低了這些患者中Bcr-Abl-SKP2軸的激活。作者隨后檢查了Spautin-1或不同濃度的IM對來自患者的CML細胞和原代單核細胞的細胞活力的影響。研究發(fā)現(xiàn)Spautin-1增強了IM在CML細胞系和患者原代單核細胞中的抗腫瘤作用。

研究結(jié)論：USP10和SKP2在CML患者的原代單核細胞中上調(diào)。

?

結(jié)論與討論

????????總之，作者的研究表明SKP2介導了K63相關(guān)的泛素化和Bcr-Abl的激活，以增強Bcr-Abl信號傳導。此外，USP10是SKP2的新型DUB，它可能與USP13一起發(fā)揮作用，介導對抗泛素化和SKP2降解的對抗作用，從而確保SKP2的高蛋白質(zhì)水平和增強的Bcr-Abl信號傳導。作者的發(fā)現(xiàn)這為細胞周期控制的失調(diào)提供了新的見解。本研究還確定了以USP10為靶點治療CML的潛在可行的治療策略。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-019-0092-z