前面幾期內容，小恒主要介紹了如何通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因敲除，本期內容小恒為大家?guī)砹嘶蚯萌耄↘nock-in）的相關知識，供大家參考學習。

當染色體DNA發(fā)生雙鏈斷裂（DSB）時，細胞一般通過兩種途徑進行修復，分別為非同源末端連接機制（NHEJ）和同源介導的雙鏈DAN修復機制（HDR）兩個途徑。NHEJ是細胞中的一種普遍發(fā)生的機制，會導致靶區(qū)的隨機插入或缺失以及基因破壞，基因敲除通常是通過此機制實現的。而同源性定向修復（HDR）途徑，對比NHEJ，HDR是更為精確的修復機制。這種修復機制主要用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的Knock-in。在該修復路徑中，將一段與預期編輯位點上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細胞中，即可實施對基因組的高精度編輯[1-3]。

Cas9 介導同源重組（HDR）除了需要多引入一條修復模板，基本操作和基因敲除（KO）基本一致。順利的情況下整套操作下來至少需要 4 周時間，其中單克隆的獲取和鑒定是最大的限速步驟。Donor載體承載所需的修飾基因片段并會被插入到基因組中的特定區(qū)域，今天我們重點認識一下這個同源修復模板（Donor載體）的構建注意事項。

1、Knock-in位點與DSB距離：使用HDR機制引入特定的突變或者插入一段序列需要在插入序列兩端加上一段同源序列。通常修飾的插入位點應距DSB不超過100bp，最理想的是不超過10bp，距離達到200bp效率會降低[4]。

2、Knock-in片段的大?。翰迦肫蔚拇笮∈怯绊懯褂胹sODN或者dsDNA作為修改模板的重要因素?？梢允褂胹sODN模板成功引入高達50bp的突變或單點突變，而使用dsDNA質粒作為修復模板則應用于較大片段的插入，例如熒光蛋白或基因表達盒[5, 6]。

3、同源臂的長度：對于ssODN，有文章已報道成功地完成了模板總長度約為100-200bp的插入，通常在預期突變的任一側具有接近50-80bp的同源臂。而對于大片段的插入，通常需要質粒作為修復模板，突變片段越大，需要的左右同源臂長度越長，一般在600到2000bp之間[7]。同時大片段的插入最好引入選擇標記，用于確認實驗是否成功[8]。?

4、防止二次切割：一旦引入并修復了DSB，CRISPR/Cas9系統(tǒng)就不會停止。只要gRNA目標位點/ PAM位點保持完整，Cas9核酸內切酶將繼續(xù)切割，DSB將通過NHEJ或HDR繼續(xù)得到修復。為了避免此種情況，可以將對應sgRNA的PAM或鄰近PAM的序列進行同義突變，以防止donor質粒插入基因組前后被Cas9識別并切割[9]。

5、同源臂的模板序列：左右同源臂建議以待突變的目的細胞基因組為模板擴增，避免不同細胞基因組差異導致左右同源臂不同源，降低HDR效率[10]。?

Knock-in實驗的成功，除了donor的選擇，實驗之前保證sgRNA的特異性，驗證sgRNA的切割活性對于Knockin實驗的成功也非常重要，這些設計方法與驗證方法與前幾期敲除中的方式一致，小伙伴們感興趣的話可以前往閱覽探討。漢恒專營工具病毒十余載，可定制用于基因敲入的質粒以及病毒工具等產品，如有技術問題或產品訂購需求，歡迎隨時咨詢！

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參考文獻

[1] Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-1278.

[2] Miura H, Gurumurthy CB, Sato T, Sato M, Ohtsuka M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Sci Rep. 2015 Aug 5;5:12799.

[3] Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D, Li J. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 2013 Dec 5;13(6):659-62.

[4] Elliott B, Richardson C, Winderbaum J, Nickoloff JA, Jasin M. Gene conversion tracts from double-strand break repair in mammalian cells. Mol Cell Biol. 1998 Jan;18(1):93-101.

[5] Yoshimi K, Kunihiro Y, Kaneko T, Nagahora H, Voigt B, Mashimo T. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun. 2016 Jan 20;7:10431.

[6] Hendriks WT, Warren CR, Cowan CA. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 2016 Jan 7;18(1):53-65.

[7] Byrne SM, Ortiz L, Mali P, Aach J, Church GM. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 2015 Feb 18;43(3):e21.

[8] Duda K, Lonowski LA, Kofoed-Nielsen M, Ibarra A, Delay CM, Kang Q, Yang Z, Pruett-Miller SM, Bennett EP, Wandall HH, Davis GD, Hansen SH, Fr?din M. High-efficiency genome editing via 2A-coupled co-expression of fluorescent proteins and zinc finger nucleases or CRISPR/Cas9 nickase pairs. Nucleic Acids Res. 2014 Jun;42(10):e84.

[9] Elliott B, Richardson C, Winderbaum J, Nickoloff JA, Jasin M. Gene conversion tracts from double-strand break repair in mammalian cells. Mol Cell Biol. 1998 Jan;18(1):93-101.

[10] Hendriks WT, Warren CR, Cowan CA. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 2016 Jan 7;18(1):53-65.