萬物皆可皮爾遜！還可以做細胞壞死相關(guān)的miRNA，所有基因集（免疫，自噬，鐵死亡等）都可以找相關(guān)的miRNA？

用于預測結(jié)腸癌預后的新定義的壞死性凋亡相關(guān) miRNA 特征

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8763259/

從 TCGA 下載了 444 個 COAD 病例的 miRNA-seq 數(shù)據(jù)。我們鑒定了 8 種差異表達的 miRNA（has-miR-16-5p、has-miR-141-3p、has-miR-148a-3p、has-miR-425-5p、has-miR-7-5p、has-miR -223-3p、has-miR-200a-5p 和 has-miR-500a-3p），然后進行 Cox 分析以確定具有明顯不同 OS 的八種 miRNA 特征預后生物標志物。預測 1 年、3 年和 5 年生存率的受試者工作特征 (ROC) 曲線的曲線下面積 (AUC) 分別為 0.663、0.653 和 0.639。多變量分析還暗示風險評分是考慮其他混雜因素的獨立預后因素（HR = 1.847, 95% CI = 1.197–2.848,?P?= 0.006）。根據(jù) Kaplan-Meier 分析，hsa-miR-500a-3p (?P= 0.003)、hsa-miR-16-5p (?P?= 0.004) 和 hsa-miR-148a-3p (?P?= 0.035) 顯著影響 OS 結(jié)果。我們預測了這三種 miRNA 的靶基因，然后篩選了 10 個中樞基因（CCND1、SMAD3、SMAD2、CDK1、TGFB2、CDC25A、CHEK1、VEGFA、CCNE1、WEE1）。此外，CHEK1與生存預后相關(guān)。我們從 TCGA 下載了 miRNA 測序數(shù)據(jù)，篩選了 8 個差異表達的壞死性凋亡相關(guān) miRNA。然后，我們使用 Cox 回歸分析建立了壞死性凋亡相關(guān) miRNA 的預測模型。最后，利用預后相關(guān)的miRNAs對靶基因進行預測，并通過功能分析探討這些靶基因的潛在作用機制。我們的研究表明，壞死性凋亡與結(jié)腸癌密切相關(guān)，八種壞死性凋亡相關(guān) miRNA 模型可能是結(jié)腸癌的預后生物標志物和治療靶點。

結(jié)果

篩選差異表達的 miRNA

作為比較來自 TCGA 數(shù)據(jù)（457 個癌癥樣本和 8 個非癌癥樣本）的 13 個 miRNA 表達水平的結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 8 個 miRNA 在表達上存在差異。腫瘤標本中所有 8 種 miRNA 的表達均升高，結(jié)果通過熱圖顯示（補充圖 1）。

構(gòu)建基于 miRNA 的預后特征

我們將來自 TCGA-COAD 研究的樣本與 427 名擁有完整生存信息數(shù)據(jù)的患者進行匹配。單變量 Cox 回歸顯示 5 個 miRNA（P值 < 0.05）與患者的 OS 相關(guān)（圖 1A）。然而，考慮到所有差異表達的 miRNA 都具有臨床意義，我們將所有 8 種差異表達的 miRNA 納入進一步分析。圖 1B）。因此，風險評分得出如下：miRNA 特征風險評分 = (0.307 × has-miR-141-3p?exp?) + (0.151 × has-miR-148a-3p?exp?) + (0.382 × has-miR-16- 5p?exp?) - (0.411 × has-miR-200a-5p?exp?) + (0.034 × has-miR-223-3p?exp?) + (0.238 × has-miR-425-5p?exp?) + (0.951 × has-miR- 500a-3p?exp?) - (0.043 × has-miR-7-5p?exp?)。使用風險評分，427 個樣本被平均劃分為不同的風險亞組。根據(jù) Kaplan-Meier 曲線，高風險組的 OS 較低（對數(shù)秩檢驗統(tǒng)計量 = 8.2，HR = 1.850，95% CI = 1.220–2.804，P?= 0.004，圖 2A）。通過 ROC 分析評估預后模型的敏感性和特異性，我們發(fā)現(xiàn) 1 年、3 年和 5 年生存率的 AUC 分別為 0.663、0.653 和 0.639。圖 2B）。

miRNA 特征模型的獨立預后價值

Cox 回歸分析用于評估 miRNA 特征模型是否可用作獨立的預后決定因素。單變量分析顯示風險評分與 OS 相關(guān)（HR = 1.856, 95% CI: 1.206–2.856,?P?= 0.005,圖 3A）。多變量分析還暗示風險評分是考慮其他混雜因素的獨立預后因素（HR = 1.847, 95% CI = 1.197–2.848,?P?= 0.006,圖 3B)，例如年齡、性別和 TMN 階段。因此，該風險評分可用于評估結(jié)腸癌的預后。此外，TMN 分期也被認為是預后的獨立指標（HR = 3.511, 95% CI = 2.230–5.528,?P?< 0.001）。

miRNA-靶基因分析

我們使用 Kaplan-Meier 曲線分析了八種 miRNA 對患者存活率的表達。從 hsa-miR-500a-3p（對數(shù)秩檢驗統(tǒng)計量 = 9.1，HR = 1.869，95% CI = 1.207–2.895，P?= 0.003）、hsa-miR-16-5p的呈現(xiàn)中觀察到對 OS 結(jié)果的顯著影響(對數(shù)秩檢驗統(tǒng)計 = 8.5, HR = 1.869, 95% CI = 1.233–2.833,?P?= 0.004), hsa-miR-148a-3p (對數(shù)秩檢驗統(tǒng)計 = 4.4, HR = 1.555, 95% CI = 1.015– 2.382,?P?= 0.035) (圖 4A–C）。根據(jù)來自三個數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，每個 miRNA 調(diào)節(jié)不同的靶基因?？偣搏@得了539個基因作為三種miRNA的靶基因（圖 4D）。為了探索 miRNA 和靶基因之間的關(guān)聯(lián)，我們使用 Cytoscape 3.8.0 構(gòu)建了這個動作網(wǎng)絡(luò)，如補充圖 2所示。該網(wǎng)絡(luò)由 542 個節(jié)點和 591 個邊組成，其中 hsa-miR-16-5p、hsa-miR-148a-3p 和 hsa-miR-500a-3p 分別對應 421、137 和 33 個靶基因。該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度的平均值和聚類系數(shù)的平均值分別為 2.2 和 0.0?；?GO 富集和 KEGG 分析，我們確定了這些靶基因的生物學功能。GO分析共獲得與結(jié)腸癌相關(guān)的靶基因338個術(shù)語（補充表2）。結(jié)果，顯示了生物過程 (BP)、細胞成分 (CC) 和分子功能 (MF) 項的前 5 項的點圖 (圖 5A）。在這三類中，靶基因的BP變化主要集中在組蛋白修飾、腺體發(fā)育和去磷酸化；MF的變化主要富集于蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸激酶活性和SMAD結(jié)合，而CC主要富集晚期內(nèi)體、轉(zhuǎn)移酶復合物和含磷基團循環(huán)內(nèi)體。結(jié)腸癌相關(guān)靶基因的KEGG通路分析顯示44個結(jié)果（補充表3），其中≥20個主要富集于PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染、癌癥中的MicroRNAs、MAPK信號通路和mTOR信號通路途徑（圖 5B）。

篩選中心基因

包含 498 個節(jié)點和 1931 條邊的 PPI 網(wǎng)絡(luò)復合體由 498 個靶基因組成。該網(wǎng)絡(luò)的平均度數(shù)和聚類系數(shù)分別為7.8和0.2。通過 Cytoscape 3.8.0 及其插件篩選了十個中心基因（CCND1、SMAD3、SMAD2、CDK1、TGFB2、CDC25A、CHEK1、VEGFA、CCNE1、WEE1）（補充圖 3）。這些hub基因的節(jié)點屬性信息，如度、介數(shù)中心性、接近中心性和聚類系數(shù)，顯示在表格1.?進行 Kaplan-Meier 分析以確定中樞基因表達如何影響患者的存活率，結(jié)果表明只有 CHEK1（對數(shù)秩檢驗統(tǒng)計 = 6.7，HR = 0.600，95% CI = 0.406–0.886，P?= 0.010）對操作系統(tǒng)（補充圖 4）。

討論

研究表明，壞死性凋亡在癌癥進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，基于靶向壞死性凋亡誘導因子的癌癥治療是癌癥治療的一種策略。18在目前的研究中，這是首次探索利用與壞死性凋亡相關(guān)的miRNAs來預測結(jié)腸癌的預后。本研究首先分析了結(jié)腸癌和正常組織中與壞死性凋亡相關(guān)的 13 個 miRNAs 的表達，然后構(gòu)建了由 8 個 miRNAs 組成的預后風險評分，以評估這些壞死性凋亡相關(guān) miRNAs 的預測價值。為了闡明這些明顯影響患者生存的壞死性凋亡相關(guān) miRNA 的機制，我們通過三個數(shù)據(jù)庫預測了它們的靶基因。功能分析表明，差異表達的miRNA與PI3K-Akt和MAPK信號通路高度相關(guān)。

我們的研究產(chǎn)生了一個由八種壞死性凋亡相關(guān) miRNA 組成的特征風險評分，并檢測到它可以預測結(jié)腸癌的 OS。在腫瘤患者中，促腫瘤 miRNA 上調(diào)，抑癌 miRNA 下調(diào)。19轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的進展和預后不良與循環(huán)中 miR-141-3p 水平的升高有關(guān)。據(jù)報道，miR-141-3p靶向PTEN，進而導致磷酸肌醇激活PI3K/Akt通路。20更重要的是，在用 LPS 處理的 Caco-2 細胞中，miR-141-3p 抑制 RIPK1 的作用，RIPK1 激活下游分子并促進壞死體形成，從而逆轉(zhuǎn)腸上皮細胞損傷。15臨床上，血清外泌體miR-425-5p水平與CRC的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可通過激活PI3K/Akt信號通路、誘導巨噬細胞M2極化、增強上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和分泌VEGF來調(diào)控PTEN促進腫瘤的發(fā)生。轉(zhuǎn)移。21?,?22

MiR-7-5p 通過靶向線粒體蛋白 SLC25A37 和 TIMM50 介導線粒體損傷，從而誘導橫紋肌肉瘤細胞凋亡和壞死性凋亡。23最近，lncRNA TINCR 可作為 miR-7-5p 海綿被提出與結(jié)直腸癌進展相關(guān)，這可能促進 miR-7-5p 介導的結(jié)直腸癌的發(fā)展。24?MiR-223-3p 對 RIP3 的表達進行負調(diào)控，顯著影響 RIP3 介導的壞死性凋亡和炎癥的抑制，從而減少脊髓神經(jīng)元損傷。25?LINC00961作為抑癌基因，通過充當miR-223-3p海綿上調(diào)其靶基因SOX11的表達，抑制結(jié)直腸癌的遷移和侵襲。26與正常結(jié)腸黏膜相比，miR-200a-5p在結(jié)直腸癌中顯著上調(diào)，但結(jié)腸腺瘤與正常黏膜無明顯差異。27?,?28據(jù)報道，miR-200a-5p及其靶基因RNF11在心臟組織中存在差異表達，過表達的miR-200a-5p誘導RIP3依賴性壞死性凋亡。29

在我們的研究中，hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-16-5p 和 hsa-miR-148a-3p 的表達顯著影響 OS 結(jié)果。研究表明，miR-500a-3p 可以與 MLKL 的 3′UTR 結(jié)合，30通過靶向 JAK/STAT3 通路的多種負調(diào)節(jié)因子，促進腫瘤干細胞的特性并驅(qū)動 STAT3 信號通路的激活。31雖然 MiR-16-5p 被認為是一種腫瘤抑制因子，32?,?33但它對結(jié)直腸癌的作用機制存在爭議。34大腸癌患者血清和血漿中 miR-16-5p 的含量明顯高于健康人，35在癌前病變患者的糞便中也觀察到了類似的現(xiàn)象。36在結(jié)直腸癌中，抑制腫瘤啟動子 miR-148a-3p 可以恢復 MHC-I 的表面水平，并通過促進鈣連接蛋白的表達顯著增強 CD8+ T 細胞介導的免疫攻擊效果。37然而，一項研究報告稱，miR-148a 的低表達與無病生存期和總生存期的顯著降低有關(guān)，38表明 miR-148a-3p 與結(jié)直腸癌之間的機制并不精確。39

通過分析可訪問的在線數(shù)據(jù)庫，我們論證了上述三種 miRNA 的潛在靶基因和功能。靶基因主要參與組蛋白修飾、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和SMAD結(jié)合，靶向PI3K-AKT和MAPK通路，在癌癥的進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。有報道顯示，抑制 TIMP1 可通過調(diào)節(jié) FAK-PI3K/AKT 和 MAPK 通路減少增殖和轉(zhuǎn)移，但增加細胞凋亡。40據(jù)報道，大黃素通過 ROS 介導的 PI3K/AKT 誘導 RIP1 和 MLKL 的高磷酸化，從而誘導腎細胞癌的壞死性凋亡。41在膠質(zhì)母細胞瘤中，作為 ROS-JNK-p53 環(huán)上游的 RIP1 和 RIP3，介導 PI3K/AKT/mTOR/P70S6K 的哺乳動物靶標，從而誘導壞死性凋亡。42

使用 Cytoscape 3.8.0 及其插件篩選出調(diào)節(jié)結(jié)腸癌 miRNA 的 10 個中樞基因（CCND1、SMAD3、SMAD2、CDK1、TGFB2、CDC25A、CHEK1、VEGFA、CCNE1、WEE1）。細胞周期蛋白是一組通過與細胞周期蛋白依賴性激酶 (CDK) 結(jié)合來調(diào)節(jié)細胞周期的蛋白質(zhì)。43研究表明，CCND1 和 CCNE1 在正常和癌結(jié)腸組織之間差異表達，后者在 TNM 早期顯著升高，與 OS 顯著相關(guān)。44在上皮性卵巢癌中，miR-490-3p 通過靶向 CDK1 調(diào)節(jié)和影響 SMARCD1 和 CCND1 的表達。45?CDK1 可以與CCNB 形成CCNB/CDK1 復合物以控制G2/M 相變，并且對于啟動有絲分裂至關(guān)重要。46CDC25A也是細胞周期相關(guān)基因，在多種癌癥中過表達，通過調(diào)節(jié)癌細胞周期促進腫瘤進展，可能是有效癌癥治療的關(guān)鍵靶點。47?SMAD蛋白是TGF-β家族受體下游的信號轉(zhuǎn)導分子。在來自不同來源的癌細胞中，酸中毒激活 TGF-β2，促進部分上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而支持 SMAD2 乙酰化。48有大量證據(jù)表明 TGF-β2 在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中含量豐富，其誘導的自噬在膠質(zhì)瘤侵襲中起著至關(guān)重要的作用。這種自噬還通過影響 SMAD2/3/7 的表達來啟動膠質(zhì)瘤中 TGF-β2 的反饋。49血管生成是腫瘤進展的必要條件。腫瘤細胞及其周圍基質(zhì)分泌的VEGFA在大多數(shù)人類腫瘤中過度表達，刺激內(nèi)皮細胞增殖和存活，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預后密切相關(guān)。50與其他與 DNA 損傷反應 (DDR) 相關(guān)的激酶一樣，WEE1 作為腫瘤抑制因子的主要生物學功能是防止 DNA 改變細胞復制。然而，越來越多的研究表明，WEE1 在各種實體瘤中過度表達，并且與預后不良有關(guān)。51

值得注意的是，CHEK1是必需基因，與患者的OS相關(guān)。Kaplan-Meier 表明，CHEK1 的高表達與更高的存活率有關(guān)。CHEK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是 DNA 損傷反應的重要調(diào)節(jié)劑。52因為它在 DNA 損傷中起調(diào)節(jié)作用，CHEK1 以前被認為是一種腫瘤抑制基因。然而，一項研究發(fā)現(xiàn)，CHEK1的差異表達和CHEK1 mRNA的降低是胃癌和結(jié)直腸癌的不良預后因素。53另一項研究表明，在結(jié)腸癌中使用特異性 miR 抑制劑治療可降低高水平的內(nèi)源性 DNA 損傷敏感 miR (DDSM)，增加 CHEK1 轉(zhuǎn)錄水平，這揭示了 CHEK1 對結(jié)腸癌的抑制作用。54

我們發(fā)現(xiàn)了一種新的 miRNA 特征風險評分，并分析了其對結(jié)腸癌預后的預測作用。我們沒有條件收集自己的臨床數(shù)據(jù)來驗證我們的模型，這是我們研究的一個局限。另外，我們沒有實驗條件來驗證這些miRNA和靶點的作用機制，這也是我們研究的局限。

結(jié)論

總之，我們的研究表明，壞死性凋亡與結(jié)腸癌密切相關(guān)，因為正常和結(jié)腸癌組織之間的 miRNA 表達存在差異。此外，我們的八種壞死性凋亡相關(guān) miRNA 模型可用作結(jié)腸癌的獨立預后分子標志物。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一種新的 miRNA 標志物，可以預測結(jié)腸癌的預后并幫助確定結(jié)腸癌的可靠治療靶點。我們篩選的十個中心基因可能是靶向癌癥治療的有效靶點，尤其是 CHEK1。此外，它們有可能成為 CRC 的生物標志物。然而，需要更多的實驗研究和臨床試驗來驗證這些目標。

材料和方法

數(shù)據(jù)集

444 名 TCGA-COAD 患者的 miRNA 測序數(shù)據(jù)于 2021 年 9 月 28 日從 TCGA 數(shù)據(jù)庫下載（https://portal.gdc.cancer.gov）。同時，獲取了由466個文件（457個癌癥樣本和8個非癌癥樣本）組成的相應臨床信息。此外，還從 TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲得了 456 名 TCGA-COAD 患者的 mRNA 測序數(shù)據(jù)，用于樞紐基因的預測分析。

鑒定差異表達的壞死性凋亡相關(guān) miRNA

我們從之前的評論中獲得了 13 種壞死性凋亡相關(guān)的 miRNA，其中12種在補充表 1中給出。使用 R 語言 4.1.1 版“l(fā)imma”包鑒定差異表達的 miRNA，P值 < 0.05。通過熱圖顯示差異表達的miRNA的表達矩陣。

壞死性凋亡相關(guān) miRNAs 預后模型的開發(fā)和評估

選擇臨床數(shù)據(jù)包括生存天數(shù)、生存狀態(tài)、年齡、性別和 TMN 分類的患者。使用 Cox 回歸分析，評估與壞死性凋亡相關(guān)的 miRNA 在 TCGA 隊列中是否具有預測價值。從 TCGA 獲得的所有差異表達的 miRNA 都包含在多變量 Cox 回歸模型中，并使用“森林圖”包顯示結(jié)果。之后，將每個 miRNA 的乘積和系數(shù)相加并計算到風險模型中。

風險評分評估

TCGA-COAD 樣本根據(jù)其中位風險評分分為兩個亞組，然后使用 Kaplan-Meier 方法比較它們的總生存 (OS) 時間。使用“survival”、“ROCR”和“timeROC”軟件包完成 1 年、3 年和 5 年 ROC 曲線。在提取了 TCGA 隊列的臨床參數(shù)，例如年齡、性別和 TMN 分期（I 或 II 與 III 或 IV）后，我們通過 Cox 回歸模型將它們與風險評分進行了分析。

目標基因預測與功能分析

通過 miRDB、miRTarBase 和 TargetScan 預測與 OS 相關(guān)的 miRNA 的靶基因。同時，我們使用 R 語言版本 4.1.1 來識別所有三個數(shù)據(jù)庫中的目標基因，我們還使用 Cytoscape 3.8.0 來繪制它們之間的關(guān)系。我們將“clusterProfiler”包應用于這些重疊基因，以進行 GO 富集分析和 KEGG 分析。17

樞紐基因篩選

STRING數(shù)據(jù)庫用于構(gòu)建基于miRNA靶點的PPI交互網(wǎng)絡(luò)。據(jù)此，將網(wǎng)絡(luò)相互關(guān)系文件導入Cytoscape 3.8.0，通過cytohubba獲取hub基因。同時，通過Kaplan-Meier方法評估hub基因是否與OS相關(guān)。

統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均使用 R 語言 4.1.1 版本和附屬包完成。