第一部分 RNA?提取策略

1、RNA降解的原因內(nèi)源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因為人體細胞自身就是幾十分鐘（20min？）mRNA被降解一輪，所以不管是組織還是細胞還是液體狀樣本在離開其中細胞的最佳生活狀態(tài)后都應(yīng)該盡快的被妥善的方法保存起來。外源性RNA酶也是一個需要注意的因素，最常見的就是毛發(fā)尤其頭發(fā)，灰塵，唾液，塑料手套這四個兄弟。針對它們我們應(yīng)該戴帽子，口罩，橡膠無菌手套，在清潔灰塵少的地方提取RNA。我上面說了內(nèi)源性RNAase污染才是關(guān)鍵，所以有些同志沒有注意這些對外源性RNAase的防護RNA也提取的很出色。但是如果你運氣不太好的話外源性RNAase污染影響很大的。

2、樣品的取材 我們抽提RNA往往都是需要其mRNA，而mRNA的表達量和細胞或者組織的生長狀態(tài)息息相關(guān)，我們?nèi)〗M織塊應(yīng)該避免取到壞死組織，而細胞我們應(yīng)該在其處于生長旺盛的時期收集（貼壁細胞消化要迅速，離心要稍為快些，甚至可以不消化下來直接進入裂解步驟；此外還可以采取先震蕩敲擊培養(yǎng)瓶的方法使細胞和培養(yǎng)瓶的結(jié)合下降，然后用吸管吹打培養(yǎng)基的方法把細胞吹打下來，這樣細胞的代謝不會明顯的受到抑制。注意在平時傳代的時候就要注意觀察細胞除了用胰酶消化下來以外是否還有其他比較簡單的方法）（此外還可以把培養(yǎng)液倒掉后迅速的加入裂解試劑開始抽提RNA）。

3、待提取樣品保存方法這些保存方法溫度從4度到零下196度不等，選擇哪一種保存方法關(guān)鍵是要對這些保存方法的優(yōu)缺點有清醒的認識。根據(jù)你需要的RNA種類可以做簡單的分類。包括RNA病毒RNA ，mRNA（各種），rRNA等，其中最容易降解或者破壞的就是mRNA，最不容易損失的就是RNA病毒RNA（因為有蛋白殼保護）。超低溫保存：特指液氮保存不管組織還是細胞如果需要其中的mRNA必須在液氮中保存，-70度等方法都是錯誤的方法，在很短的時間內(nèi)或許可以，但是長期是不可能的。-20~~~-70攝氏度保存：RNA病毒的RNA可以在這個溫度段安全的保存。但是其產(chǎn)生的mRNA還是必須超低溫保存。

4、RNA提取提取RNA可以分為總RNA，mRNA，Virus RNA（RNA病毒）幾類Trizol即異硫氰酸胍-苯酚法，這種方法的原理是：首先用強變性劑異硫氰酸胍裂解細胞，同時使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性，釋放出核酸。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH時溶解度不同，分別位于整個體系中的中間相和水相，從而使DNA和RNA分離開來。進一步通過有機溶劑來抽提沉淀RNA，就可以得到純凈的RNA。

注意各種方法對于組織都需要先碾磨，應(yīng)該用陶瓷碾磨器，同時一定要在碾磨同時不斷的加入液氮。（少數(shù)牛人號稱從來不加液氮也提取的很好，我只能說他運氣實在不錯）。

試劑盒提取的其優(yōu)點有以下幾點：

1、提取的mRNA純度高，因為對于很多實驗rRNA其實也是一種污染，我們只想RT我們需要的mRNA，但是如果用特異性引物或者隨機引物就會連rRNA 一起RT，造成大量的我們不需要的cDNA出現(xiàn)。

2、鑒定時觀察是否有嚴重的DNA污染時非常方便。mRNA抽提后電泳只是看到淡淡的一條短拖影帶，此時如果有DNA污染可以很容易發(fā)現(xiàn)，因為背景很淺。

3、RNA的鑒定RNA抽提出來之后，首先做的工作是分裝保存，然后取其中一管用于鑒定。

鑒定方法如下：對RNA的鑒定包括幾個方面，第一是數(shù)量的鑒定，第二是質(zhì)量的鑒定，重點是質(zhì)量的鑒定。

一般的瓊脂糖凝膠電泳，注意不要用甲醛變性電泳（又不是做northern，實在沒有必要）。電泳槽注意一定不要用DEPC處理，一定要保證電泳體系中有少量的RNAase存在。分別在加樣孔中加入1，2，3μlRNA抽提溶液。在旁邊加入DNA marker。1%瓊脂糖凝膠，10V/cm的電壓，電泳10min成像一次，看電泳情況，如果28s和18s還沒拉開，繼續(xù)電泳10min成像，如果仍沒有拉開再次電泳5min。如果還沒有分開多半28s已經(jīng)遭到破壞，不可能看到典型的3條帶了。

A、RNA應(yīng)該呈現(xiàn)出3條rRNA帶。分別是5，18，28SrRNA的帶。5s最好是要可見，除非抽提步驟中故意將其破壞。

B、28s亮度是18s亮度的一倍，其他比例關(guān)系均提示RNA有一定程度的破壞。

C、不能有多的帶出現(xiàn)。出現(xiàn)多的帶有兩個可能，一是DNA污染帶，二是rRNA破壞斷裂帶。

D、rRNA之間可以看到很淡的，霧蒙蒙的mRNA拖帶。

E、瓊脂糖凝膠被RNAase處理后電泳帶基本消失，沒有明顯的，邊緣清晰的帶殘留（不用說這些就是明顯的DAN污染，而且是很大量的DNA污染）

如何用RNAase處理凝膠呢，為何要處理?? DNA是不會被RNAase破壞的，所以我們發(fā)現(xiàn)凝膠有可疑的帶需要鑒定其到底是RNA還是DNA，如果是DNA就有比較大的問題了，如果是RNA到不用過份擔(dān)心，因為只是提示有rRNA斷裂而已。我們可以在RNA電泳完成后，把膠用薄膜手套包好（RNase的良好來源），放置5－10h后再次成像。如果前面起初的帶減弱并模糊了說明是RNA被降解，如果出現(xiàn)某個帶或者拖影一直不見模糊，那么DNA污染的可能性就大了（由于RNA被降解，有時膠放置一陣后反而更清晰了。）

注意RNA電泳加DNA marker是很有必要的（雖然很多白癡說不需要，那是因為沒有意識到具體DNA marker的作用）。DNA marker加進去后，一來可以指示RNA電泳中可疑帶的位置，方便和在膠被放置后成像的結(jié)果進行比較。注意比如28S在某個位置，有時候，膠被放置后28S降解帶會前后移動，不一定就在最初的位置形成一團降解后圖象。其次DNA marker有顯示瓊脂糖凝膠的功能狀態(tài)的作用。EB等染色劑會揮發(fā)造成成像沒有結(jié)果，DNA在膠中也會輕微彌散，此時如果膠放置后發(fā)現(xiàn)上面空空的，沒有帶出現(xiàn)，不要太高興，不一定就是RNA在膠上降解完全了。事實上有可能是EB揮發(fā)引起膠不顯色的結(jié)果，尤其有些人把膠一直泡在buffer中的情況。此外發(fā)現(xiàn)帶型開始模糊也不一定就是RNA降解的結(jié)果，也可能是核酸都在彌散開。所以DNA marker是非常重要的。

第二部分 RT-PCR

成功的RT PCR的要素

1、高質(zhì)量的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly（A）+ RNA，都可以檢測到擴增結(jié)果。另外，分離poly（A）+ RNA會導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。但是我個人認為不會，除非mRNA抽提試劑盒或者相關(guān)方法對內(nèi)參以及目的基因的mRNA有選擇性，否則樣本間抽提效率的差別完全可以用內(nèi)參來校正。然而，當分析稀有mRNA時，poly（A）+ RNA會增加檢測的靈敏度。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10，000×g離心5分鐘。也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保護試劑。Merck的inhibitor是世界第一，大家可以選擇性使用。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

2、使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。不管是M-mlV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。而且降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性會加大RT酶的熱穩(wěn)定性。通常有點突變和缺失突變兩種，優(yōu)先選擇缺失突變的。此外AMV酶熱穩(wěn)定性更高，推薦。

3、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度較高的溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物（三種引物都可以的）在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。這個方法可以試一試。但是這個步驟之后反應(yīng)條件如何設(shè)置我沒有經(jīng)驗，是加入酶和其他反應(yīng)組分后變性再RT還是直接開始RT程序？我認為后者才對。此外是否可以考慮加入RNA inhibitor更為安全一些。還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助于防止較低溫度時所發(fā)生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。上面簡單的處理方法倒是不花錢，呵呵。對這些困難模板的擴增可以使用一些特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以置于較高溫度下進行，增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計的保溫溫度相同。此外注意不要在高于60℃時使用oligo（dT）和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。此外RNA在高于65℃時開始水解，對于≤1kb的RNA第一鏈合成溫度可以為70℃，對于＞1kb的RNA則需要＜65℃。

4、使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的增強劑包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到第一鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結(jié)構(gòu)，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MmlV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。為了在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到PCR中，那甘油在擴增反應(yīng)中的濃度為0.4%，這不足以抑制PCR。5、RNaseH處理在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對于某些模板，據(jù)認為cDNA合成反應(yīng)中的RNA會阻止擴增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡRNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。通常是不推薦此方法的。

三種RT引物的選擇

Oligo dT?要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA適用。他主要適合長鏈甚至全長mRNA的RT，這樣對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，最好不要有明顯的DNA污染，RNA降解和RNA斷裂（如電泳中出現(xiàn)多條非典型的帶而又明確不是DNA帶那么就要考慮RNA出現(xiàn)斷裂的情況）其RT通常有標準濃度，比較好掌握。隨機引物適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況，關(guān)于是否對具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板有特殊的優(yōu)點只能說maybe，事實上很多情況下我們是沒有分析RNA的二級結(jié)構(gòu)的。引物退火后面不遠處如何出現(xiàn)嚴重連續(xù)二級結(jié)構(gòu)是我們需要注意的，改用隨機引物做RT倒是是比較好的選擇，但是如果不在PCR階段針對性的修改策略是不行的。特異性引物注意只能用你設(shè)計引物時的下游引物做RT，自己畫圖就明白了。適合各種RNA的RT，適合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物設(shè)計質(zhì)量影響RT的結(jié)果，而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以按照說明書按照一個溫度做不是最佳選擇，這樣對操作者的技戰(zhàn)術(shù)水平提出了嚴峻挑戰(zhàn)。所以通常適用于引物設(shè)計和合成有保障，引物退火處之后沒有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)，目的模板豐度高的情況。通常不推薦。有些試劑核諸如Qiagen的RT試劑盒很討厭不帶隨機引物和Oligo dT，這時可以先用特異性引物試一試，看看情況再說，做不出來也不要緊，這不是RT的最佳選擇，只是不用多花錢的妥協(xié)選擇而已。至于其合成的cDNA更為特異從而以后PCR更為特異的說法雖然有一定的道理，但是純屬于理論性質(zhì)的，不能作為選擇他的原因。通常加入某個引物RT，然后用這個引物擴增還是可以得到很多非特異擴增產(chǎn)物的，只是片斷一般不超過400bp。所以使用特異性引物特異性更高的說法不能全信，尤其是擴增片斷比較短的時候（小于400bp）。因為很少有RT酶可以在退火溫度反應(yīng)而不失活的。除非少數(shù)耐熱的很貴的RT酶。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細胞基因編輯

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