這次魯大師二話不說，直接上干貨！ 先來一個CRISPR-cas9介紹！?

CRISPR-Cas9 是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。.?而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，則是從微生物中得到啟發(fā)對靶向基因進行特定DNA編輯的技術(shù)。

根據(jù)用途可以分成三類：

①?基因敲除（CRISPR knockout）

②?基因激活 （CRISPR activation）

③ 基因干擾（CRISPR interference）

在自然中CRISPR系統(tǒng)分為三部分：

第一部分是Cas9蛋白，它是一種核酸酶，可以切割基因。

第二部分是crRNA（CRISPR RNA），作用就像個導(dǎo)游，可以定位到目標基因，和靶位點序列配對。

第三部分是tracrRNA（Trans-activating crRNA），有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

三者結(jié)合形成復(fù)合物，可謂是手拉手，齊干活，實現(xiàn)基因編輯。

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隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展，我們可以在體外把crRNA和tracrRNA進行人為構(gòu)建，這樣我們就等于有了更加便捷的工具。體外合成的crRNA和tracrRNA 結(jié)合體就是sgRNA。

大家的科研老朋友安捷倫圍繞sgRNA 提供一系列貼心服務(wù)， 媽耶一下子就實現(xiàn)了實驗自由有沒有！搞好sgRNA，CRISPR-Cas9再也不迷路，想切哪里切哪里啊

第一步：sgRNA 設(shè)計

安捷倫在線Suredesign 平臺，你只需要注冊一個自己的賬戶就可以去定制安捷倫旗下左右的服務(wù)，當然也包括我們的sgRNA設(shè)計。

只需要注冊一個賬戶，然后點擊Sureguide圖標，按照步驟進行設(shè)計，最后就可以得到我們目的基因的sgRNA序列。

在設(shè)計的過程中，我們可以選擇各種參數(shù)，例如Protospacer adjacent motif（PAM），最常用的就是NGG.

第二步：sgRNA合成

定制化學合成sgRNA：安捷倫擁有SurePrint專利技術(shù)，可以合成高質(zhì)量的sgRNA，還有獨特的修飾技術(shù)，來增強sgRNA的穩(wěn)定性，定制序列可長達 140 nt，根據(jù)要求可提供更長的序列。數(shù)量從 100 μg 到 100 mg (3–3000 nmol)，可適應(yīng)您不同的實驗規(guī)模，采用研究和開發(fā)級 GMP 材料。且化學修飾是不需要額外收費的。

體外合成gRNA試劑盒：安捷倫還提供SureGuide gRNA 合成試劑盒（貨號5190-7719），可在 2 小時內(nèi)合成和純化 gRNA，節(jié)省實驗時間。合成系統(tǒng)是經(jīng)過廣泛優(yōu)化和驗證的，我們拿到可以直接使用，無需再考慮試劑問題。這一款適合來源于各種 DNA 模板設(shè)計的 gRNA 轉(zhuǎn)錄，靈活性較高。試劑盒中還包含對照模板 DNA，可以用來確認反應(yīng)是否成功。

第三步：sgRNA質(zhì)控

生成的sgRNA 必須先過質(zhì)量控制這一關(guān)，才能繼續(xù)下面的實驗。如果咱們的sgRNA 本身已經(jīng)被降解了，或者不純，那會嚴重影響我們后續(xù)的實驗。安捷倫有一系列的自動化電泳質(zhì)控儀器，今天魯大師以安捷倫2100生物分析儀為例，來給大家介紹。我們可以使用安捷倫小RNA試劑盒在安捷倫2100生物分析儀上進行分析。將純化后gRNA樣品稀釋到檢測定量范圍，在80°C下變性2分鐘（以減少二級結(jié)構(gòu)），?按照說明書進行分析。在生物分析儀中我們可以直接得到RNA質(zhì)量分析結(jié)果

除了檢測sgRNA是否完整之外，還可以通過2100生物分析儀檢測sgRNA的片段大小以及sgRNA的樣本定量。這樣我們就可以獲得sgRNA全面的質(zhì)控信息，來決定下一步實驗是否繼續(xù)。

第四步：合成sgRNA 效率驗證

SureGuide Cas9核酸酶試劑盒（貨號5190-7715）是用于體外 CRISPR-Cas9 研究的一體化解決方案的重要組成部分。利用該試劑盒可實現(xiàn)較大基因或DNA 片段的體外克隆，并且消除了常見限制性內(nèi)切酶或 PCR 保真度的限制，一看就是非常的給力。除此之外，安捷倫還提供一款更加便利的SureGuide CRISPR/Cas Complete Kit,（貨號?5190-7714），這一款包含了體外sgRNA合成和Cas9核酸酶等所有的配套試劑，咱們只需要設(shè)計好sgRNA就可以愉快的做實驗啦。

接著安捷倫2100生物分析儀再次出馬，用來驗證目的基因酶切效率，檢驗是否敲除成功。這一次咱們可以選取High sensitive DNA 試劑盒（貨號5067-4626）來進行驗證。通過2100生物分析儀我們可以得到膠圖。通過圖片可知M3-GUSB樣本實驗失敗, M2-GUSB比E2-GUSB樣本酶切效率會低，因為M2-GUSB留下了更多未被酶切的模板。