3.2.1 PCR技術(shù)

一、PCR定義及原理

1.定義

依據(jù)半保留復(fù)制，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。

2.PCR的原理

PCR技術(shù)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法，也稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，原理為DNA的半保留復(fù)制。在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制類似。

3.特點(diǎn)

①多起點(diǎn)

②雙向

③邊解旋，邊復(fù)制

④半保留

二、PCR的條件及過(guò)程

1.條件

（1）模板：DNA母鏈

（2）原料：4種脫氧核苷酸

（3）引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3"端開(kāi)始連接脫氧核苷酸

①長(zhǎng)度通常為20-30個(gè)脫氧核苷酸

②引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列而引起自身折疊，引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列

③PCR反應(yīng)中有兩種引物

（4）耐高溫的聚合酶（Taq DNA聚合酶）：催化合成DNA子鏈。

（5）緩沖液、Mg2+：提供PCR反應(yīng)合適的酸堿度與某些離子；Taq酶的活性需要Mg2+。

2.過(guò)程

PCR的過(guò)程包含變性、復(fù)性和延伸三個(gè)階段。

三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

1.方法及原理

（1）方法：瓊脂糖凝膠電泳

（2）原理：

①DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下會(huì)向正極泳動(dòng)。DNA分子質(zhì)量越小，遷移速率越快。

② 凝膠中的DNA分子可通過(guò)核酸染料染色被檢測(cè)出來(lái)。如核酸染料溴化乙錠（EB)

2.材料及過(guò)程

(1）材料用具：電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽、制膠槽、梳子等）、微量移液器、紫外檢測(cè)儀、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。

（2）過(guò)程：配膠→點(diǎn)樣→電泳→檢測(cè)

3.電泳圖分析

（1）Marker（M）：標(biāo)準(zhǔn)樣，一個(gè)已知分子質(zhì)量的DNA樣品，作為對(duì)照，用來(lái)確定待測(cè)樣品中DNA的相對(duì)分子質(zhì)量。

（2）DNA熒光條帶：

①條帶的有無(wú)：代表是否成功擴(kuò)增出待測(cè)樣品中的DNA。若無(wú)條帶，常見(jiàn)原因有：無(wú)DNA模板，引物設(shè)計(jì)不合適。

②條帶的亮度：代表擴(kuò)增的DNA數(shù)量，越亮代表DNA數(shù)量越多

③條帶的位置：常代表DNA的大小。一般距離點(diǎn)樣孔越遠(yuǎn)，說(shuō)明跑的越快，DNA的分子質(zhì)量越小。

4.PCR的應(yīng)用

廣泛應(yīng)用于基因工程目的基因的獲取、遺傳病的診斷、刑偵破案和DNA序列測(cè)定等。