質(zhì)譜流式技術(shù)（Mass Cytometry）在藥物開發(fā)和生物藥物表征中的潛力巨大。質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)將質(zhì)譜技術(shù)與流式細(xì)胞儀相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對單個(gè)細(xì)胞的生化成分進(jìn)行深入研究，幫助我們理解疾病機(jī)制，驗(yàn)證藥物的效果，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)以及增強(qiáng)生物制藥質(zhì)量控制。這在生物藥物表征中非常有用，它可以幫助解決以下一些問題：

單細(xì)胞層次的分子表征：傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)通常需要大量的樣本以獲取可靠的結(jié)果，而質(zhì)譜流式技術(shù)則可以分析單個(gè)細(xì)胞的生化成分，這可以幫助我們更深入地理解細(xì)胞的生物學(xué)特性。

生物分子的定量分析：質(zhì)譜流式技術(shù)可以對細(xì)胞內(nèi)的生物分子進(jìn)行定量分析，包括蛋白質(zhì)、代謝物和其他生物分子。

細(xì)胞異質(zhì)性的研究：細(xì)胞群體中的細(xì)胞并非完全相同，它們之間的差異可能影響疾病的發(fā)展和治療的效果。質(zhì)譜流式技術(shù)可以幫助我們研究這種細(xì)胞異質(zhì)性。

百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式細(xì)胞儀（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于單細(xì)胞質(zhì)譜分析，該平臺能夠完成包括單細(xì)胞捕獲、cDNA合成、實(shí)時(shí)定量PCR分析、目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增以及質(zhì)譜流式細(xì)胞分析。

質(zhì)譜流式實(shí)驗(yàn)整個(gè)流程可以分為四大部分：panel設(shè)計(jì)、樣品制備、上機(jī)獲取數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)分析（圖1）。其中panel設(shè)計(jì)是最初也是最重要的步驟，它決定了整個(gè)實(shí)驗(yàn)分析的指標(biāo)和后續(xù)分析的側(cè)重點(diǎn)。

1、確定檢測指標(biāo)

確定檢測指標(biāo)之前，首先需要對于整個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的有清楚的認(rèn)識，最好首先回答以下問題：

（1）關(guān)注什么問題？疾病相關(guān)、細(xì)胞譜系發(fā)育還是其他。

（2）實(shí)驗(yàn)樣本來源？人、小鼠還是其他。

（3）實(shí)驗(yàn)樣本是什么？血液、組織還是其他。

（4）關(guān)注什么細(xì)胞類型？多種免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、某種特定的細(xì)胞類型等。

（5）希望檢測什么指標(biāo)？免疫細(xì)胞分型marker、胞內(nèi)信號通路及磷酸化水平、細(xì)胞因子分泌變化還是其他。

（6）指標(biāo)類型？經(jīng)典的標(biāo)志物、非通用的潛在標(biāo)志物還是其他。

（7）檢測指標(biāo)的細(xì)胞定位？細(xì)胞膜還是細(xì)胞質(zhì)。

明確了研究目的后，就可以開始確定檢測指標(biāo)。最常見的使用質(zhì)譜流式研究的思路是比較不同情況下，機(jī)體免疫系統(tǒng)的變化，也就是免疫細(xì)胞豐度和亞群的差異。一般了解免疫細(xì)胞常見的細(xì)胞表面標(biāo)志物有三種方法，分別是抗體公司網(wǎng)站、標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)調(diào)研（圖2）。細(xì)胞分型是流式檢測的重要應(yīng)用方向，因此各個(gè)抗體公司均有對現(xiàn)各細(xì)胞標(biāo)志物的總結(jié)。一些標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫也會對各細(xì)胞或組織進(jìn)行總結(jié)[1]。通過文獻(xiàn)調(diào)研也可以知道細(xì)胞標(biāo)志物如何選取，一般在文章的方法部分或補(bǔ)充治療中都會對指標(biāo)的選擇進(jìn)行描述。除了細(xì)胞表面的標(biāo)志物以外，質(zhì)譜流式還能檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子以及信號通路等一系列指標(biāo)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要合理搭配檢測指標(biāo)。

2、質(zhì)譜流式可用的抗體要求

確定的檢測指標(biāo)之后，還需要確定檢測的指標(biāo)是否有適配質(zhì)譜流式實(shí)驗(yàn)的抗體。目前，用于質(zhì)譜流式實(shí)驗(yàn)的抗體可以分為兩大類：已有金屬標(biāo)簽標(biāo)記的抗體和需要自行標(biāo)記金屬標(biāo)簽的流式裸抗。已有金屬標(biāo)簽標(biāo)記的抗體可以從質(zhì)譜流式儀器的廠家購買。如果現(xiàn)有的金屬標(biāo)記抗體不能滿足實(shí)驗(yàn)需求，可以購買流式裸抗自行標(biāo)記金屬標(biāo)簽，而購買的流式抗體可以通過多個(gè)廠家購買，需注意的是抗體應(yīng)是Purified以及標(biāo)注了適用FC，ICFC，CyTOF-ready（圖3）。

3、質(zhì)譜流式的金屬通道特點(diǎn)

質(zhì)譜流式相對于傳統(tǒng)流式技術(shù)的主要差異在于使用金屬元素及其同位素作為抗體標(biāo)簽，目前用作標(biāo)簽的主要有稀土元素、惰性元素、后過渡金屬和鹵素，這些元素在細(xì)胞內(nèi)含量少，不會引起高背景（圖4）。

質(zhì)譜流式對于各個(gè)金屬通道檢測的靈敏度不同。以Helios為例，理論上它能夠檢測多達(dá)135個(gè)金屬通道，范圍為75-209 amu。然而，Helios儀器內(nèi)的離子光學(xué)器件被調(diào)整為對159-169Da范圍內(nèi)的金屬檢測最為靈敏，特定質(zhì)量通道的相對靈敏度與相應(yīng)同位素通過Helios質(zhì)譜儀的離子光學(xué)系統(tǒng)的傳輸效率成正比（圖5）。

傳統(tǒng)流式的熒光信號溢出會影響到臨近的通道，而對于質(zhì)譜流式而言，這個(gè)問題沒有那么嚴(yán)重，但是也存在著少量的干擾（圖6）。

主要由以下幾個(gè)原因?qū)е拢?/p>

（1）同位素純度不夠（Impurities）。

自然存在的元素是同位素的混合物，質(zhì)量標(biāo)簽的富集度與該同位素的自然豐度有關(guān)。當(dāng)同位素的自然豐度超過20%時(shí)，通?？梢赃_(dá)到98%以上的富集度，每種同位素的純度是在生產(chǎn)時(shí)確定的。當(dāng)同位素自然豐度不夠時(shí)，可能導(dǎo)致其純度的降低（圖7）。

（2）豐度靈敏度（Abundance Sensitivity）

M±1，是指相鄰?fù)ǖ赖囊缏环Q為豐度靈敏度，簡單說就是質(zhì)量為M的峰的拖尾，在 M+1和M-1質(zhì)量上的信號干擾。在質(zhì)譜流式儀器中的飛行時(shí)間質(zhì)譜，離子是根據(jù)它們的相對速度來分辨的，這些速度由它們的質(zhì)量和動能決定。質(zhì)量差異極小的離子在初始位置和速度上相互之間有很小的差異，這些位置和速度的差異導(dǎo)致了質(zhì)量峰的擴(kuò)大，導(dǎo)致一些信號可以在相鄰的質(zhì)量通道中測量。豐度靈敏度在不同儀器的特定操作條件下是一個(gè)固定值，通常CyTOF小于1%，CyTOF 2和Helios小于0.3%。

（3）氧化物干擾（Oxides）

M+16，是指同位素氧化導(dǎo)致的干擾，如輕鑭系元素（139～160 amu）因?yàn)檠趸锏男纬?，?dǎo)致了對重鑭系元素（155~176 amu）通道產(chǎn)生干擾。在等離子體電離源的高溫下，氧化物的豐度由原子離子-氧鍵強(qiáng)度決定。La、Ce、Pr和Nd同位素產(chǎn)生最大的M+16信號（通常為2-3%），而Eu同位素形成最弱的M+16信號（通常<0.1%）。89Y, 102Pd, 104Pd, 105Pd, 106Pd, 108Pd, 110Pd, 113In, 115In, 和 209Bi 同位素不會產(chǎn)生氧化干擾，也不會對輕、重鑭系元素產(chǎn)生氧化干擾。

4、將檢測指標(biāo)與金屬通道匹配

通過合理的將檢測指標(biāo)和金屬通道匹配，可以最大程度的減弱各通道之間的干擾進(jìn)而達(dá)到最佳的檢測效果。

首先，了解各個(gè)金屬通道特點(diǎn)。根據(jù)金屬通道的特點(diǎn)，可將金屬通道分為四種類型（圖11）：（1）基本不受影響，也不影響其他通道的金屬；（2）基本不受影響，但會影響其他通道的金屬；（3）基本不影響其他通道，但會受其他通道影響的金屬；（4）其他。

其次，了解各個(gè)指標(biāo)流式抗體的特點(diǎn)。不同的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度不同，因此需要計(jì)算各個(gè)指標(biāo)流式抗體的Signal和Tolerance這兩個(gè)指標(biāo)。Signal被定義為流式分布中最強(qiáng)陽性群的75分位數(shù)，是反映一個(gè)抗體的信號強(qiáng)度的數(shù)值。Tolerance一般是流式圖分布的75分位數(shù)的20%，反應(yīng)了一個(gè)抗體信號的抗干擾能力，但在不同的流式分布中有不同的計(jì)算方法（圖12）。Signal和Tolerance不需要計(jì)算的非常精確，估計(jì)出來的數(shù)據(jù)基本可以反映一個(gè)抗體大概的強(qiáng)弱情況，即可滿足要求。

最后，就是將抗體和金屬通道相匹配。同傳統(tǒng)流式一樣，針對不同表達(dá)豐度的標(biāo)志物，也遵循「強(qiáng)弱搭配」原則，即表達(dá)豐度高的標(biāo)志物選擇較低或中等靈敏度的同位素標(biāo)簽；表達(dá)豐度低的標(biāo)志物選擇高靈敏度的同位素標(biāo)簽。對于表達(dá)豐度低或未知的抗原：選擇高靈敏度通道，如 153–176Ln、209Bi；選擇不會或很少受到其他通道干擾的通道。對于表達(dá)豐度高的抗原：選擇較低靈敏度的標(biāo)簽（89Y, 102–110Pd, 113In, 115In）或中等靈敏度的標(biāo)簽（139–152Ln）；選擇不會或很少干擾其他通道的通道；優(yōu)化抗體濃度，使用滿足需求的最低抗體濃度，從而降低對其他通道的干擾。此外，還可以遵循以下規(guī)則：互斥抗原（如 CD4 和 CD8）可以安排在有干擾的通道。共表達(dá)抗原（如 CD3 和 CD4）安排在互不干擾的通道。

質(zhì)譜流式儀器的公司也提供了panel設(shè)計(jì)的軟件（?Maxpar Panel Designer v2.0 Software），可以申請賬號來在線使用該軟件。

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang X, Lan Y, Xu J, Quan F, Zhao E, Deng C, Luo T, Xu L, Liao G, Yan M, Ping Y, Li F, Shi A, Bai J, Zhao T, Li X, Xiao Y. CellMarker: a manually curated resource of cell markers in human and mouse. Nucleic Acids Res. 2019 Jan 8;47(D1):D721-D728. doi:10.1093/nar/gky900. PMID: 30289549; PMCID: PMC6323899.

[2] Chevrier S, Crowell HL, Zanotelli VRT, Engler S, Robinson MD, Bodenmiller B. Compensation of Signal Spillover in Suspension and Imaging Mass Cytometry. Cell Syst. 2018 May 23;6(5):612-620.e5. doi: 10.1016/j.cels.2018.02.010. Epub 2018 Mar 28. PMID: 29605184; PMCID: PMC5981006.

[3] ?Maxpar Panel Designer User Guide

（https://www.standardbio.com/area-of-interest/panel-design#highlights-anchor）.