1、? 概念：在結(jié)構(gòu)上屬于蛋白質(zhì)的藥物。來(lái)源：（1）天然提取；（2）化學(xué)合成或半合成；（3）現(xiàn)代生物技術(shù)制備。

2、? 生物技術(shù)藥物：生物技術(shù)藥物是指有現(xiàn)代生物技術(shù)手段，如基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)制備生產(chǎn)的藥物。

3、? 蛋白質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過(guò)肽鍵相連形成的高分子含氮化合物。

4、? 蛋白質(zhì)能做為藥物的原因：（1）作為生物催化劑；（2）代謝調(diào)節(jié)作用；（3）免疫保護(hù)作用；（4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存；（5）運(yùn)動(dòng)與支持作用；（6）參與細(xì)胞間信息傳遞。

5、? 蛋白質(zhì)元素組成特點(diǎn)：各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%。

6、? 氨基酸的性質(zhì)：兩性解離和等電點(diǎn)；光學(xué)性質(zhì)；重要化學(xué)反應(yīng)：（1）與茚三酮反應(yīng)：用于氨基酸定量定性測(cè)定；（2）（Sanger反應(yīng)）與DNFB反應(yīng)用于N端測(cè)定。（3）Edman反應(yīng)：與PITC反應(yīng)用于N端測(cè)序，蛋白質(zhì)測(cè)序儀設(shè)計(jì)原理的依據(jù)。

7、? 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：指多肽鏈中氨基酸的排列順序，主要的化學(xué)鍵包含肽鍵，部分蛋白質(zhì)含有二硫鍵。

8、? 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)：指蛋白質(zhì)分子空間的三維結(jié)構(gòu)，既立體空間的構(gòu)象，在蛋白質(zhì)分子中各元素圍繞某些化學(xué)鍵進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，從而形成各種空間排布及相互關(guān)系。

9、? 肽鍵平面是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位：參與肽鍵的6個(gè)原子：C1，C，O，N，H，C2位于同一平面，此同一平面上6個(gè)原子構(gòu)成了所謂的肽單元。

10、?????????? 二級(jí)結(jié)構(gòu)：一條多肽鏈中局部原子的空間排布；二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本形式：（1）a-螺旋；（2）β－折疊；（3）β－轉(zhuǎn)角；（4）無(wú)規(guī)卷曲；

11、?????????? 無(wú)規(guī)卷曲是用來(lái)闡述沒(méi)有規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。是相對(duì)沒(méi)有規(guī)律性的排布，但是其同樣表現(xiàn)重要的生物學(xué)功用；二級(jí)結(jié)構(gòu)的維系力：氫鍵。

12、?????????? 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是以一級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。一段肽鏈的氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成a－螺旋或β－折疊，它就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

13、?????????? 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)：一條多肽鏈中全部氨基酸殘疾（或全部元素）的空間相對(duì)位置。既肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。包括主鏈，側(cè)鏈的全部?jī)?nèi)容。主要的化學(xué)鍵：氫鍵、離子鍵、疏水鍵、范德華力等。

14、?????????? 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)：有些蛋白質(zhì)含有兩條或多條肽鏈，每一條都有完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，每條肽鏈稱為亞基。（蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。維系亞基之間的結(jié)合力有：疏水鍵、范德華力以及氫鍵和離子鍵，還有二硫鍵。

15、?????????? 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定ph值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的ph值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pi。

16、?????????? 由于蛋白質(zhì)的分子量很大，在水溶液中形成1－100nm的微粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄缘鞍踪|(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘疾，對(duì)水有很高的親和性，通過(guò)水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一水化層，同時(shí)這些顆粒帶有電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體。

17、?????????? 如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。

18、?????????? 沉淀方法類(lèi)別：（1）高濃度中性鹽(鹽析、鹽溶）；（2）酸堿等電點(diǎn)沉淀；（3）有機(jī)溶劑沉淀；（4）重金屬鹽沉淀；（5）生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀；（6）加熱變性沉淀。

19、?????????? 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性：蛋白質(zhì)各自特有的高級(jí)結(jié)構(gòu)；是表現(xiàn)其物理性質(zhì)和化學(xué)特性以及生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。當(dāng)天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學(xué)因素的影響，使其分子內(nèi)部原有的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能都隨之改變或喪失，但并未導(dǎo)致其一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象稱為變性作用。表征：生物活性喪失；物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)改變。

20、?????????? 蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)：雙縮脲反應(yīng)；福林酚試劑反應(yīng)；茚三酮反應(yīng)；蛋白質(zhì)定量，定性的常用測(cè)定方法。

21、?????????? 蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200－230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。

22、?????????? 蛋白質(zhì)組成分析：（1）水解；（2）衍生：在游離氨基酸殘疾上衍生一個(gè)生色基團(tuán)；（3）色譜。最終獲得蛋白質(zhì)或多肽中各氨基酸所占摩爾分?jǐn)?shù)或摩爾比。

23、?????????? 酸性水解：得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺、谷氨酰胺分別被完全水解為天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸則被完全破壞，半胱氨酸不能從樣品中直接測(cè)定，酪氨酸部分被水解液中恒量雜質(zhì)所破壞，絲氨酸和蘇氨酸被部分水解。

24、???????????? 對(duì)某些氨基酸的破壞率、需要用不同的水解時(shí)間測(cè)定這些氨基酸的含量，然后外推到水解時(shí)間0H，算得的氨基酸含量，即代表了真正數(shù)值。

25、???????????? 有些脂肪族氨基酸殘基間的肽鍵難于裂解，可通過(guò)延長(zhǎng)水解時(shí)間來(lái)解決。但長(zhǎng)時(shí)間的水解會(huì)使較敏感的氨基酸殘基損失更大。

26、???????????? 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先將蛋白質(zhì)用過(guò)甲酸氧化后再水解，相應(yīng)得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。

27、???????????? 堿性水解：多數(shù)氨基酸遭到破壞，其它氨基酸消旋，僅色氨酸穩(wěn)定。所以此法僅限于測(cè)定色氨酸的含量。

28、???????????? 酶水解：用一組蛋白酶水解肽鏈，特別適用于對(duì)化學(xué)水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)是水解過(guò)程中氨基酸不發(fā)生消旋化，幾乎可以保持所有的組成氨基酸不被破壞。缺點(diǎn)是反應(yīng)需要較長(zhǎng)時(shí)間，水解的產(chǎn)物為較小的肽段，水解不完全。另外，酶本身也是蛋白質(zhì)，對(duì)樣品的結(jié)果測(cè)定可能會(huì)有干擾。

29、???????????? 微波輻射能水解：微波是一種高頻電磁波，其能量傳遞是通過(guò)分子的極化，而水分子的極化作用是非常高的，微波能量的快速吸收能導(dǎo)致完全水解的時(shí)間大大縮短。在微波輔助酸水解和酶水解中，水解時(shí)間可從幾十小時(shí)縮短至幾十分鐘。

30、???????????? 膜上蛋白質(zhì)印跡樣品的水解（原位分析）：如果蛋白質(zhì)樣品采用電泳法分離，很難從凝膠中洗脫下來(lái)，可采用電印跡法把樣品轉(zhuǎn)移到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上，然后在PVDF膜上直接進(jìn)行鹽酸水解和氨基酸分析，稱之為原位分析。

31、???????????? 色氨酸的保護(hù)：水解酸中添加保護(hù)劑：巰基乙酸和β－巰基乙醇。3mol/L巰基乙磺酸或4mol/L甲磺酸在水解時(shí)對(duì)色氨酸有一定保護(hù)作用。酶：利用蛋白酶作為水解劑，條件溫和，對(duì)天冬氨酸和谷氨酰胺及色氨酸均無(wú)破壞作用。堿：用氫氧化鈉或氫氧化鋇代替酸水解，可保護(hù)色氨酸不被破壞。

32、???????????? 半胱氨酸的保護(hù)：還原烷化法：產(chǎn)生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化試劑包括40乙烯吡啶和碘代乙酸。缺點(diǎn)：為了確保試劑接近巰基，還原和氧化通常要在變性劑存在下進(jìn)行，多余試劑盒變性劑要用HPLC、沉淀法或透析去除，沒(méi)一步都可能造成樣品的損失。

33、???????????? 氧化反應(yīng)：過(guò)甲酸氧化反應(yīng)被用來(lái)轉(zhuǎn)化半胱氨酸和胱氨酸稱為半胱氨酸再進(jìn)行測(cè)定。缺點(diǎn)：會(huì)影響其他氨基酸特別是甲硫氨酸會(huì)轉(zhuǎn)變成加硫氨酸砜，酪氨酸會(huì)降解。必須準(zhǔn)備能分析兩次的樣品量，一次提供半胱氨酸數(shù)據(jù)，另一次則提供其他氨基酸的組成數(shù)據(jù)。

34、???????????? 衍生是將氨基酸衍生為有利于測(cè)定或分離的化合物。大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無(wú)法直接用紫外法檢測(cè)，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。從衍生角度看，氨基酸分析可分為柱前衍生和柱后反應(yīng)法兩大類(lèi)。

35、???????????? 柱后反應(yīng)法：將游離氨基酸經(jīng)過(guò)色譜柱分離后，各種氨基酸再與顯色劑作用。優(yōu)點(diǎn)：比較穩(wěn)定，對(duì)樣品預(yù)處理要求低，容易定量和自動(dòng)化操作。缺點(diǎn)：檢測(cè)靈敏度不高，分析時(shí)間長(zhǎng)。

36、???????????? 柱前衍生法：將氨基酸和化學(xué)偶聯(lián)試劑先反應(yīng)生成氨基酸的衍生物，然后再用色譜柱將各種衍生物分離，直接檢測(cè)衍生物的光吸收或熒光發(fā)射。優(yōu)點(diǎn)：分析靈敏度高，可用HPLC進(jìn)行氨基酸分析。缺點(diǎn)：有點(diǎn)衍生物不穩(wěn)定，衍生試劑可能干擾氨基酸檢測(cè)。

37、???????????? 幾種常見(jiàn)的氨基酸衍生化方法：（1）茚三酮反應(yīng)；（2）熒光胺法；（3）鄰苯二甲醛法（OPA）；（4）PTC－AA法；（5）DNS－CI法；（6）硫酰氯二甲胺偶氮苯法。

38、???????????? 氨基酸的定性和定量分析一般用：紙層析；雙向紙層析；薄層層析；HPLC；離子交換層析柱等方法。

39、???????????? 蛋白質(zhì)的末端測(cè)定：

40、???????????? N端分析方法：二硝基氟苯法；二甲氨基萘磺酰氯法；異硫氰酸苯酯法；DABITC法，氨肽酶法。

41、???????????? 二硝基氟苯在弱堿性條件下，與肽鏈的N端氨基作用，形成二硝基苯基肽鏈（DNP—肽）經(jīng)酸水解后，N端殘基成為二硝基苯基－氨基酸，可用有機(jī)溶劑（如乙醚）抽提，再進(jìn)行紙層析或薄層層析后，根據(jù)層析斑點(diǎn)的位置作定性鑒定。

42、???????????? FDNB還可以與側(cè)鏈上的基團(tuán)反應(yīng)，但水解后產(chǎn)物極性較強(qiáng)，不被乙醚抽提。當(dāng)N端氨基是脯氨酸或羥脯氨酸時(shí)，不能進(jìn)行測(cè)定。

43、???????????? DNS－CL法：熒光劑DNS－CI可與肽鏈N端氨基反應(yīng)生成DNS－肽，經(jīng)酸水解，N－末端殘基形成DNS－氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用層析法鑒定。DNS－氨基酸于360nm和280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，根據(jù)熒光點(diǎn)位置確定N端氨基酸。

44、???????????? PIT－氨基酸在268nm處有強(qiáng)吸收峰

45、???????????? DABITC能與N端氨基反應(yīng)生成DABTH－氨基酸，經(jīng)層析分離后，用鹽酸氣熏即可出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，很容易鑒定。

46、???????????? C端測(cè)定：羧肽酶法，硼氫化鋰法（與C端氨基反應(yīng)后生成相應(yīng)的a－氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用層析法分離鑒定。），肼解法。

47、???????????? 封閉N－末端測(cè)定：沒(méi)有游離的氨基端

48、???????????? 乙?；疦端：肼解條件下，N端的乙?；纬梢阴ｋ拢缓笫蛊渑cDNS－CI作用，形成N乙酰－N’－丹磺酰肼經(jīng)乙醚抽提后可應(yīng)用薄層層析等方法鑒定；吡咯烷酮羧酸末端：牛肝焦谷氨酸氨肽酶能水解出末端的吡咯烷酮羧酸，從而使剩下的有自由氨基端的肽鏈可以用Edman方法遞減分析。甲?；┒耍捍嬖谟谠梭w系的初生肽鏈的端部。弱酸條件下處理48小時(shí)即可。

49、???????????? 二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：采用圓二色譜測(cè)定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

50、???????????? 三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：X射線衍射法和核磁共振技術(shù)是研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法

51、???????????? 蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量控制的要點(diǎn)：（1）蛋白質(zhì)純度檢查；（2）蛋白質(zhì)含量測(cè)定；（3）蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)的鑒定；（4）殘余雜質(zhì)檢測(cè)。

52、???????????? 蛋白質(zhì)純度檢查：世衛(wèi)組織規(guī)定必須用HPLC和非還原SDS－PAGE兩種方法測(cè)定，其純度都應(yīng)達(dá)到95%以上才能合格；純度的檢測(cè)通常是在原液中進(jìn)行。

53、???????????? 從蛋白制劑中檢測(cè)出少量的污染蛋白質(zhì)是很困難的。因?yàn)槲廴镜鞍踪|(zhì)的量很可能低于很多測(cè)定方法的檢測(cè)下限。制劑中往往含有大量的輔料。當(dāng)用一種方法測(cè)定蛋白質(zhì)純度時(shí)，可能有兩種或更多的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相似的行為。這種類(lèi)似的行為可能會(huì)導(dǎo)致本來(lái)是混合物的樣品也被認(rèn)為是均一物質(zhì)的錯(cuò)誤結(jié)論。只用一種方法作為純度試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是很不可靠的，必須選擇多種測(cè)定純度的方法。最好的純度標(biāo)準(zhǔn)是建立多種分析方法，從等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量、疏水性等不同的角度來(lái)證明了蛋白質(zhì)樣品的均一性。純度最終取決于所用的方法的類(lèi)型和分辨力，低分辨率的方法檢測(cè)到結(jié)果改用高分辨率方法時(shí)就有可能證明它是不純的。

54、???????????? 采用HPLC、非還原SDS－PAGE法測(cè)純度。

55、???????????? 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)定此項(xiàng)目主要用于原液比活性計(jì)算和成品規(guī)格的控制。蛋白含量采用福林酚試劑法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、雙縮脲法、紫外吸收法、HPLC法和凱氏定氮儀法。ELISA法。HPLC法。

56、???????????? 蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)的鑒定：

57、???????????? （1）特異性鑒別試驗(yàn)：主要確定蛋白質(zhì)的抗原性（2）免疫學(xué)方法：根據(jù)抗原抗體特異反應(yīng)建立的方法。重組產(chǎn)品通常用免疫印跡和點(diǎn)免疫進(jìn)行鑒定，特別當(dāng)電泳出現(xiàn)兩條或兩條以上區(qū)帶時(shí)則應(yīng)該用免疫印跡進(jìn)行鑒定。半干膠轉(zhuǎn)移免疫印跡法是最常用的方法。印跡的效率取決于蛋白質(zhì)從膠上轉(zhuǎn)移到膜上的效率以及蛋白質(zhì)與膜結(jié)合的效率。

58、???????????? （2）相對(duì)分子量測(cè)定：還原型SDS－PAGE測(cè)定。質(zhì)譜法。

59、???????????? （3）等電點(diǎn)測(cè)定：可以表征藥物的理化性質(zhì)和純度。均一的重組蛋白質(zhì)只有一個(gè)等電點(diǎn)。常用的測(cè)定方法：等電聚焦電泳法（IEF）；毛細(xì)管電泳法：（CE）用紫外檢測(cè)，適用于某些不易染色的蛋白質(zhì)多肽。

60、???????????? （4）肽圖分析：測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)，工藝穩(wěn)定性。肽圖裂解方法：（1）化學(xué)裂解法；（2）蛋白酶裂解法；（3）特殊處理：二硫鍵、空間構(gòu)象較復(fù)雜的特殊產(chǎn)品。

61、???????????? 肽圖常用的分析方法：（1）SDS－PAGE電泳；（2）反向HPLC；（3）毛細(xì)管電泳；（4）液質(zhì)分析。

62、???????????? 吸收光譜：某一重組蛋白來(lái)說(shuō)，其最大吸收波長(zhǎng)是固定的。在生產(chǎn)過(guò)程中沒(méi)批產(chǎn)品的紫外吸收光譜應(yīng)當(dāng)是一致的。

63、???????????? 氨基酸組成分析：是結(jié)構(gòu)分析的輔助手段，質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。在生產(chǎn)的控制中，樣品的氨基酸組成結(jié)果應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品一致。

64、???????????? N和C端氨基酸測(cè)序，必須測(cè)N端15個(gè)氨基酸，C端應(yīng)測(cè)1－3個(gè)。

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