原理

取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與乳膠顆粒在不同培養(yǎng)條件下混合后定量加入?24孔板，37 ℃，5% CO2?培養(yǎng)箱中孵育后，熒光顯微鏡下計數(shù)吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

材料與儀器

• 小鼠、1640培養(yǎng)基、小牛血清、雙抗

• 臺盼蘭手術(shù)器械、一次性注射器

• 眼科鑷、眼科剪、96 孔板、CO2?培養(yǎng)箱

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 如果采用刺激物，則可在實(shí)驗(yàn)前三天腹腔注射 3% 巰基乙醇酸鈉每只 2 mL，獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)要多一些。不采用刺激物，直接開始下面的步驟。

2. 拉頸處死小鼠，在 75% 酒精浸泡 1~2 分鐘，移入超凈臺中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。

3. 用注射器抽取 5 mL 含雙抗的?RPMI1640培養(yǎng)基?注入腹腔，用綿球輕揉腹部 1~2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個小口，用吸管吸取細(xì)胞懸液，移入離心管中。

4. 1000 rpm 離心 5 min 后，用含雙抗的?RPMI1640培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心，重懸細(xì)胞于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中，如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)，將細(xì)胞稀釋到目的濃度后，接種即可。

5. 如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，調(diào)整濃度至 2×105個/mL，接種到 96孔板中，每孔 100~200 μL；如 果作為其它實(shí)驗(yàn)使用，可以調(diào)整成 2x106/mL，加到 24 孔平底培養(yǎng)板中，1 mL/孔；5% CO2?溫箱孵育 2 h 后， 換液，并用?RPMI1640培養(yǎng)基洗 1~2 次，棄去未粘附細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為單層的巨噬細(xì)胞。

結(jié)果

巨噬細(xì)胞剛貼壁時偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細(xì)胞有吞噬的特性，當(dāng)與細(xì)菌混合在一起的時候，在40 倍物鏡下可以看到巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，因此，巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以清除部分污染的細(xì)菌、支原體和部分細(xì)胞碎片。

注意事項(xiàng)

1. 嚴(yán)格無菌操作，在超凈臺內(nèi)進(jìn)行；

2. 為避免交叉感染，每一只小鼠更換注射器；

3. 吸管吸取細(xì)胞懸液的時候，盡量不要吸到大小腸，否則容易引起成纖維細(xì)胞污染。

常見問題

巨噬細(xì)胞一般沒有特殊的鑒定方法，有兩條經(jīng)驗(yàn)：

1. 巨噬細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不會增殖

2. 很難消化下來，所以接種的時候，必須直接接種到目的培養(yǎng)器皿中。

來源：“ 聚研生物”公眾號，環(huán)凱生物小編整理。 ?
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