歐易單細(xì)胞測(cè)序助力解析阿茲海默癥B細(xì)胞分子標(biāo)志物！2021年12月8日，四川大學(xué)華西醫(yī)院王廷華課題組與遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科余昌胤課題組協(xié)作，利用單細(xì)胞測(cè)序在Experimental & Molecular Medicine發(fā)表了AD分子標(biāo)志物相關(guān)成果，歐易生物提供了該篇文章的測(cè)序和分析服務(wù)。

? 研究背景??

阿茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）一直是醫(yī)學(xué)界的一大難題，給老齡化人口帶來(lái)持續(xù)負(fù)擔(dān)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界約有5000萬(wàn)人患有AD或其他形式的癡呆癥。目前，AD可通過(guò)神經(jīng)心理檢查、血液檢查、神經(jīng)影像學(xué)檢查、基因檢查等進(jìn)行診斷。過(guò)去幾年中，國(guó)際工作組將生物標(biāo)志物整合到診斷過(guò)程中，并于2014年開始將AD生物標(biāo)志物劃分為診斷標(biāo)志物和進(jìn)展標(biāo)志物，以覆蓋疾病的所有階段（從無(wú)癥狀狀態(tài)到癡呆最嚴(yán)重階段）。已有報(bào)道，外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮促進(jìn)作用。

? 文章信息??

文章題目：Single-cell RNA sequencing reveals B cell–related molecular?biomarkers for Alzheimer’s disease

發(fā)表期刊：Experimental & Molecular Medicine

樣本類型：4例AD患者（2例早期，2例晚期）和2例正常對(duì)照的PBMCs

組學(xué)技術(shù)：scRNA-seq（共獲得46244個(gè)細(xì)胞）

影響因子：8.75

? 文章簡(jiǎn)介??

本文通過(guò)對(duì)4例AD患者（2例早期，2例晚期）和2例正常對(duì)照的PBMCs進(jìn)行scRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)AD患者血液中B細(xì)胞明顯減少。通過(guò)流式分選檢測(cè)43例AD患者和41例正常人的PBMCs，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞減少與患者的臨床癡呆評(píng)分（Clinical Dementia Rating, CDR）密切相關(guān)。為了證實(shí)B細(xì)胞在AD進(jìn)展中的作用，作者對(duì)AD早期小鼠進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中小鼠纖維斑塊開始出現(xiàn)。結(jié)果表明，在AD早期，B細(xì)胞耗竭明顯加速并加重了AD小鼠的認(rèn)知功能障礙和腦內(nèi)淀粉樣肽負(fù)荷（Aβ負(fù)荷）。更重要的是，隨著疾病進(jìn)展，B細(xì)胞中有18個(gè)基因特異性上調(diào)，7個(gè)基因特異性下調(diào)，其中一些基因與AD密切相關(guān)，使B細(xì)胞預(yù)測(cè)AD嚴(yán)重程度成為可能，有助于識(shí)別臨床AD進(jìn)展。

?研究結(jié)果??

1.?scRNA-seq分析PBMCs異質(zhì)性

MRI掃描顯示，與正常個(gè)體相比，晚期AD患者出現(xiàn)腦萎縮和心室擴(kuò)張（圖1a）。6個(gè)樣品中N1、N2、EA1、EA2、LA1、LA2分別獲得7906、6842、6957、3648、9959和10932個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞（圖1b）。利用高變量基因的平均表達(dá)值計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)，可視化數(shù)據(jù)集的組間變異性，相關(guān)值從0.8101到0.9496，顯示樣本間細(xì)胞類型分布的高一致性（圖1c-d）。

圖1 單細(xì)胞RNA-seq分析樣本PBMCs異質(zhì)性

2.?驗(yàn)證AD患者PBMCs亞群差異

對(duì)6個(gè)細(xì)胞亞群差異表達(dá)基因的KEGG分析表明，上調(diào)基因主要富集在造血細(xì)胞系、成骨細(xì)胞分化和T細(xì)胞受體等信號(hào)通路，下調(diào)基因主要富集在RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、FoxO信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、凋亡、鞘脂信號(hào)通路和mRNA監(jiān)視通路（圖2a-b）。將PBMCs分成6個(gè)細(xì)胞類型（圖2c），在AD早期和晚期患者的PBMCs中，B細(xì)胞百分比較正常對(duì)照組明顯降低（圖2d-f）。

圖2 AD患者PBMCs細(xì)胞亞群差異

3.?分析AD患者PBMCs細(xì)胞亞群的基因表達(dá)譜

聚類分析每個(gè)細(xì)胞類型基因表達(dá)，計(jì)算AD不同階段的基因表達(dá)差異（圖3a）。每個(gè)細(xì)胞亞群中差異表達(dá)的基因，根據(jù)其隨著疾病發(fā)展的表達(dá)趨勢(shì)分為上調(diào)基因和下調(diào)基因（圖3b）。對(duì)各細(xì)胞類型的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞上調(diào)的基因在AD中均表現(xiàn)出富集；top 5富集信號(hào)通路中，在B細(xì)胞中富集最多（圖3c）。

圖3?AD患者PBMCs亞群基因表達(dá)譜

4.?分析B細(xì)胞中差異表達(dá)基因

利用TBtools制作的維恩圖發(fā)現(xiàn)6個(gè)不同細(xì)胞類型中特異性上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)量，除重疊區(qū)域外，B細(xì)胞中特異性上調(diào)基因有361個(gè)，下調(diào)438個(gè)；CD4+T細(xì)胞中特異性上調(diào)基因有108個(gè)，下調(diào)724個(gè)；CD8+T細(xì)胞中特異性上調(diào)基因有176個(gè)，下調(diào)278個(gè)（圖4a-b）；并發(fā)現(xiàn)在B細(xì)胞中特異性上調(diào)或下調(diào)的基因在其他細(xì)胞亞群中沒有明顯變化（圖4c-d）。根據(jù)AD納入標(biāo)準(zhǔn)，作者收集了43例AD患者和41例正常受試者的PBMCs（圖4f），發(fā)現(xiàn)AD患者的T細(xì)胞（23.9%）和B細(xì)胞（3.37%）分別少于正常對(duì)照組（36.9%和8.54%）（圖4g）。B細(xì)胞數(shù)量與CDR評(píng)分相關(guān)性分析表明，B細(xì)胞數(shù)量與AD的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；即B細(xì)胞越少，AD發(fā)展越嚴(yán)重（圖4h-j）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，確定B細(xì)胞為AD的特異性生物標(biāo)志物。

圖4 B細(xì)胞差異基因

5.?B細(xì)胞缺失導(dǎo)致AD小鼠認(rèn)知功能下降

為了進(jìn)一步驗(yàn)證B細(xì)胞在AD進(jìn)展中的作用，作者對(duì)16周齡的AD小鼠進(jìn)行B細(xì)胞衰竭實(shí)驗(yàn)（B cell depletion treated，BCDT）。連續(xù)進(jìn)行3個(gè)月后，作者采用開放場(chǎng)試驗(yàn)、Morris水迷宮試驗(yàn)和Y迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠認(rèn)知功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與無(wú)癡呆的WT小鼠相比，認(rèn)知功能障礙最嚴(yán)重的是AD + BCDT小鼠，其次是AD + PBS小鼠。

6.?B細(xì)胞衰竭增加了AD小鼠大腦的Aβ沉積

免疫組化結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，AD小鼠海馬和皮質(zhì)淀粉樣斑塊負(fù)荷增加，而AD + BCDT小鼠比AD + PBS小鼠增加更明顯。同時(shí)進(jìn)一步明確了Aβ斑塊在海馬四個(gè)區(qū)域的分布，AD + BCDT小鼠的斑塊數(shù)量高于AD + PBS小鼠（圖5a-b）。

圖5 B細(xì)胞耗竭對(duì)Aβ沉積的影響

7.?鑒定B細(xì)胞特異性差異基因

正常人和AD不同階段患者中表達(dá)頻率最高的 100個(gè)上調(diào)/下調(diào)基因中，有18/7個(gè)顯著的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜。在B細(xì)胞中，上調(diào)基因KIR3DL2、QPCT和PPP2R2B均參與神經(jīng)功能和神經(jīng)退行性疾?。▓D6a），下調(diào)基因FRAT2和WWC3參與Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，與AD發(fā)病機(jī)制相關(guān)（圖6b）。下調(diào)基因SPG20可介導(dǎo)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)，線粒體鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能障礙可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species, ROS）積累，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，這是AD的早期特征之一。

從scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析上述差異表達(dá)基因在B細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著疾病的進(jìn)展，KIR3DL2、QPCT和PPP2R2B在B細(xì)胞中的表達(dá)高于正常水平，SPG20、FRAT2和WWC3的表達(dá)低于正常水平（圖6c-d）。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)AD早期和晚期B細(xì)胞中KIR3DL2和PPP2R2B的表達(dá)顯著上調(diào)，而在其他細(xì)胞類型則不如此；隨著AD的發(fā)展，WWC3和SPG20在B細(xì)胞中顯著下調(diào)，單核細(xì)胞中PPP2R2B水平顯著升高，而SPG20顯著下降（圖6e-f）。

圖6 特征基因的鑒定和驗(yàn)證

?文章結(jié)論?

1. 通過(guò)單細(xì)胞RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)AD患者血液中B細(xì)胞明顯減少；而通過(guò)流式分選，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞減少與患者的臨床癡呆評(píng)分密切相關(guān)；

2. 在AD早期，B細(xì)胞耗竭加速并加重AD小鼠的認(rèn)知功能障礙和Aβ負(fù)荷。隨著疾病進(jìn)展，B細(xì)胞中一些特異性上調(diào)和下調(diào)基因與AD密切相關(guān)；

3. 基于B細(xì)胞預(yù)測(cè)AD嚴(yán)重程度成為可能，這有助于識(shí)別臨床AD進(jìn)展。

?參考文獻(xiàn)?

Xiong, LL., Xue, LL., Du, RL.?et al.?Single-cell RNA sequencing reveals B cell–related molecular biomarkers for Alzheimer’s disease.?Exp Mol Med?(2021).

?歐易生物單細(xì)胞事業(yè)部?

單細(xì)胞事業(yè)部建立于2018年，已成為歐易生物的核心部門之一。先后引入多套10x Genomics和 BD RhapsodyTM，流式細(xì)胞儀等主流的高通量單細(xì)胞分選平臺(tái)，已獲得10x Genomics公司授權(quán)的單細(xì)胞基因表達(dá)和空間轉(zhuǎn)錄組雙平臺(tái)服務(wù)提供商認(rèn)證，并與北京、廣州等地協(xié)同科研院所分別成立聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室。

團(tuán)隊(duì)成員50余人，博士學(xué)歷5人，碩士及以上學(xué)歷人員比例達(dá)40%以上；擁有300m2獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室，可完成樣本處理、細(xì)胞分選、文庫(kù)構(gòu)建和空間轉(zhuǎn)錄等的實(shí)驗(yàn)。

單細(xì)胞事業(yè)部成立至今，已完成1000+個(gè)項(xiàng)目、6000+例樣本的單細(xì)胞解離與測(cè)序，參與或協(xié)助客戶發(fā)表近50篇高水平文章。歐易生物單細(xì)胞事業(yè)部致力于為廣大科研工作者提供周到、貼心、專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，專注于以客戶的口碑鑄就品牌形象。

END

單細(xì)胞技術(shù)支持部? 撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

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