Nat Biotechnol｜MAS-Seq 方法學(xué)獲生物科技領(lǐng)域權(quán)威期刊肯定
????????短讀長的RNA-seq已經(jīng)被應(yīng)用接近了20年，RNA-seq最常被用于分析基因的差異表達，從那時起它已經(jīng)成為分子生物學(xué)中最常用的工具之一，極大的加速了我們對生物學(xué)的理解。但至今為止，準(zhǔn)確量化和發(fā)現(xiàn)RNA可變剪切亞型（isoform）對基于短讀長的RNA-seq仍然是一個挑戰(zhàn)。
????????使用 PacBio Iso-Seq 測序方法可以捕獲完整的轉(zhuǎn)錄亞型，但是因為通量有限，并沒有被廣泛應(yīng)用，尤其是在單細胞轉(zhuǎn)錄組測序領(lǐng)域。為了解決這個問題，Broad研究所的研究人員開發(fā)了MAS-ISO-seq技術(shù)，這是一種以編程方式將互補DNA (cDNA)連接成最適合HiFi測序的檢測長度的技術(shù)，能夠將單細胞全長轉(zhuǎn)錄組測序通量提高了15倍以上。相關(guān)研究于2023年6月8日發(fā)表于生物科技領(lǐng)域的權(quán)威期刊《自然－生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）。
????????為了驗證MAS-ISO-seq忠實還原RNA isoform的能力，研究人員對Lexogen SIRV-Set4進行了全長RNA測序。Lexogen SIRV-Set4是一種合成的RNA標(biāo)準(zhǔn)品（包含不同摩爾濃度的69種RNA異構(gòu)體和4-12k的不同長度）。如下圖所示：Smart-seq3異構(gòu)體組裝會有高達43%的錯誤率，而MAS-ISO-seq可以直接識別isoform，無需生信組裝，只有0.4%的錯誤。
????????為了表征MAS-ISO-seq在單細胞轉(zhuǎn)錄組測序中的性能，研究人員對腫瘤浸潤性CD8+T細胞進行了10x Genomics 單細胞測序。在經(jīng)過QC和數(shù)據(jù)過濾之后，最終獲得了5,270個CD8+T細胞，其中中位UMIs為4,041 UMIs/細胞（短讀長測序）和1,701UMIs/細胞（MAS-ISO-seq）。
????????雖然利用短讀長測序和HiFi測序得到的測序深度差異很大，細胞聚類和基因表達卻高度一致，如下圖所示。這說明僅通過HiFi測序就能夠獨立且穩(wěn)健地獲得細胞聚類結(jié)果。
????????利用T細胞分化過程中CD45的不同剪接模式，研究人員使用CITE-seq在蛋白質(zhì)水平上對CD45亞型表達進行了正交驗證，并將結(jié)果與使用MAS-ISO-seq檢測的mRNA水平進行了比較。結(jié)果顯示，這兩種模式之間的CD45亞型表達高度一致，如下圖所示。
????????與基于抗體的CITE-seq方法相比，單細胞長讀長轉(zhuǎn)錄組在解析多種編碼CD45亞型（RO、RA、RAB和RBC）方面的能力更加精細。這是因為抗體的單表位特異性限制可能無法區(qū)分密切相關(guān)的亞型。例如，CD45 RA抗體不能區(qū)分CD45 RA和RAB。
????????基于MAS-ISO-seq方法學(xué)，PacBio現(xiàn)已推出針對單細胞全長轉(zhuǎn)錄組測序的建庫試劑盒 MAS-seq kit。通過將短的10x Genomics cDNA 進行串聯(lián)建庫的方式連接起來再進行HiFi測序，從而解決了長讀長單細胞RNA測序的通量瓶頸。
PacBio MAS-Seq的主要特點：
1. 支持由 10x Chromium Next GEM Single Cell 3' 試劑盒?(v3.1) 生成的 cDNA；
2. cDNA 起始量為 15-75 ng；
3. 相較于傳統(tǒng)常規(guī)單細胞Iso-Seq文庫，MAS-Seq將通量擴展了16倍；
4. 突破傳統(tǒng)基因水平研究，得到更多全長轉(zhuǎn)錄本信息；
5. 在單細胞水平上，實現(xiàn)多樣化全長轉(zhuǎn)錄本的表征；
?6. 研究發(fā)現(xiàn)細胞種類特異性的可變剪切群體，及其表達差異；
?7. 可以全面解析單細胞的可變剪切、mRNA點突變和融合基因等信息；
8. 一個文庫即可以獲得 3000-10000 個細胞的轉(zhuǎn)錄本水平信息；
9. 當(dāng)搭配Sequel?II/IIe??SMRTcell 8M 測序芯片時，可產(chǎn)生 4000 萬條轉(zhuǎn)錄本序列;
10. 當(dāng)搭配Revio SMRTcell 25M 測序芯片時，可產(chǎn)生 8000?萬條轉(zhuǎn)錄本序列。
Sequel II/IIe 和 Revio 系統(tǒng)上運行的 PBMC MAS-Seq 文庫的 Reads、細胞和轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
參考文獻：
Al'Khafaji, Aziz M et al. “High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation.”?Nature biotechnology, 10.1038/s41587-023-01815-7. 8 Jun. 2023, doi:10.1038/s41587-023-01815-7
