基因編輯經(jīng)驗(yàn)豐富如你，是否遇到過以下詭異的場景：

1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率非常高：滿屏都是blingbling的綠色熒光；

2）gRNA切割效率特別好：pool測序后PAM處的套峰肉眼可見；

可是單克隆鑒定結(jié)果一出來，要么是野生型（WT），要么是雜合子（KO+WT），要么是有敲除3的倍數(shù)基因型，重新來一次還是相同的結(jié)果……?到底是怎么回事呢？

將目的基因從細(xì)胞中敲除，并觀察由此產(chǎn)生的表型，是生物學(xué)研究中確定基因功能的常用策略，如用于研究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控或結(jié)構(gòu)組成等。然而，有些基因?qū)?xì)胞活力至關(guān)重要，基因敲除后會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此通過常規(guī)方法難以獲得ko純合克隆。這類基因被稱為細(xì)胞生長的必需基因，引言中描述的現(xiàn)象很可能就是敲除了必需基因?qū)е潞Y不到純合子。

根據(jù)全基因組篩查結(jié)果表明，必需基因約占人類總基因的10%[1]。如果你不確定基因是否為細(xì)胞的必需基因，如何在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行有效甄別，少走彎路呢？最先想到的方法可能是查找文獻(xiàn)，看是否有相同細(xì)胞和基因敲除的成功案例。但是查文獻(xiàn)畢竟費(fèi)時間和精力，而且經(jīng)常找不到完全一樣的基因和細(xì)胞案例。隨著CRISPR文庫篩選的廣泛應(yīng)用，越來越多的細(xì)胞全基因組敲除數(shù)據(jù)被公開。源井生物匯集了1400+[1]細(xì)胞系近3000w的海量敲除數(shù)據(jù)，只需輸入細(xì)胞和基因名，即可一鍵評估項(xiàng)目致死風(fēng)險（圖1.2）并查找成功案例（圖3）。

話說回來，如果恰好遇上高風(fēng)險基因的敲除，只能束手無策嗎？當(dāng)然不是，源井生物根據(jù)多年細(xì)胞基因編輯經(jīng)驗(yàn)，為你整理了3大解決方案。

1、退而求其次

如果基因徹底敲除后會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可以通過RNAi降低基因的表達(dá)觀察是否有表型變化。如果基因敲低有表型，發(fā)文一般沒問題。

RNAi文獻(xiàn)案例：通過RNAi方法下調(diào) MTA1的表達(dá)，可以導(dǎo)致ER α在ER陰性乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231中重新表達(dá)，并降低 MMP-9 和 CyclinD1 的蛋白水平，以及減少腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖,更多的細(xì)胞被阻斷在G0/G1期(P < 0.05)。MTA1的沉默作用可有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和增殖。針對MTA1的shRNA干擾可能在人類乳腺癌中具有潛在的治療效用[2]。

2、迎難而上，挑戰(zhàn)概率

如果干擾效果確實(shí)不好，而基因也只是有一定致死概率的，可以嘗試多篩一些克隆看能否幸運(yùn)獲得純合子。如果沒有獲得純合子，KO雜合子或者ko-pool也可以檢測一下表達(dá)情況，有時候KO雜合子也有表型，可用于發(fā)文。

KO雜合子文獻(xiàn)案例：NAT10 是一種核仁蛋白，包含一個乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和一個tRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有組蛋白乙?；钚?，參與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的調(diào)控。該基因在絕大部分腫瘤細(xì)胞中是必需基因，完全敲除后會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)死亡。作者使用CRISPR技術(shù)在Lovo細(xì)胞中獲得NAT10+/-的敲除雜合，進(jìn)行免疫熒光、Western?blotting和測序驗(yàn)證。與對照細(xì)胞 (LoVo) 相比，NAT10+/?細(xì)胞顯示MN形成減少，即NAT10表達(dá)下調(diào)可以抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展[3]。

這里補(bǔ)充一點(diǎn)，有些敲除致死的基因，可以通過加入特殊添加劑，人為補(bǔ)充細(xì)胞生長所需養(yǎng)分，使細(xì)胞正常生長增殖，等到細(xì)胞擴(kuò)增至足夠量之后，再撤銷添加劑，進(jìn)行功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。比如白血病細(xì)胞系中敲除DHODH基因后，需要在培養(yǎng)基中添加～100μM的尿苷維持細(xì)胞生長[4]。

3、調(diào)整方案，條件性敲除

如通過使用tet-off系統(tǒng)和CRISPR/Cas9結(jié)合的方法，先用tet-off系統(tǒng)外源表達(dá)目的基因，再將內(nèi)源基因敲除，篩選到KO純合克隆擴(kuò)增后，通過加Dox誘導(dǎo)外源基因表達(dá)關(guān)閉，實(shí)現(xiàn)基因誘導(dǎo)敲除[5]。或通過使用生長素誘導(dǎo)降解系統(tǒng)（Auxin-inducible degron，AID），將AID敲入形成融合蛋白替代內(nèi)源基因表達(dá)，通過添加生長素進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)降解，實(shí)現(xiàn)基因功能敲除[6]。此外，也有將CRISPR/Cas9和cre/loxp系統(tǒng)結(jié)合，進(jìn)行條件性敲除的策略。

以上3種解決方案，各有優(yōu)缺點(diǎn)，第1種RNAi替代法操作最簡單，成本較低，成功率高，但有可能出現(xiàn)干擾效果不好，敲除不徹底的問題。第2種加大范圍篩選法，只適合部分致死率較低的基因，不確定性較高，時間和費(fèi)用成本也比較高。第3種條件性敲除策略費(fèi)用最高，tet-off系統(tǒng)也可能存在部分背景表達(dá)的情況，KI的方法則難度較高?？偟膩碚f，可以結(jié)合時間、經(jīng)費(fèi)和具體基因進(jìn)行方案選擇。

[1]Wang T, Birsoy K, Hughes N W, et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome[J]. Science, 2015, 350(6264): 1096-1101.

[2]?Jiang Q, Zhang H, Zhang P. ShRNA-mediated gene silencing of MTA1 influenced on protein expression of ER alpha, MMP-9, CyclinD1 and invasiveness, proliferation in breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7 in vitro[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2011, 30(1): 1-11.

[3]?Cao Y, Yao M, Wu Y, et al. N-acetyltransferase 10 promotes micronuclei formation to activate the senescence-associated secretory phenotype machinery in colorectal cancer cells[J]. Translational Oncology, 2020, 13(8): 100783.

[4]?Sykes D B. The emergence of dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) as a therapeutic target in acute myeloid leukemia[J]. Expert opinion on therapeutic targets, 2018, 22(11): 893-898.

[5]?Liao J, Karnik R, Gu H, et al. Targeted disruption of DNMT1, DNMT3A and DNMT3B in human embryonic stem cells[J]. Nature genetics, 2015, 47(5): 469-478.

[6]?Nishimura K, Fukagawa T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9[J]. Chromosome Research, 2017, 25: 253-260.