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超級增強(qiáng)子（Super enhancer）是一類包含多個(gè)普通增強(qiáng)子的大簇，主要富集高密度的轉(zhuǎn)錄因子、輔助因子及增強(qiáng)子相關(guān)表觀修飾位點(diǎn)。與普通增強(qiáng)子相比，超級增強(qiáng)子具有更高的轉(zhuǎn)錄激活能力，在細(xì)胞類型特異性發(fā)育、分化以及腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

超級增強(qiáng)子的鑒定是依據(jù)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)記分子結(jié)合水平強(qiáng)度的差異，這些分子包括輔因子 (如Mediator、cohesin)、組蛋白修飾標(biāo)記 (如H3K27ac、H3K4me1)、染色質(zhì)修飾分子 (如p300) 和BET家族蛋白（BRD4）等。當(dāng)前超級增強(qiáng)子的鑒定主要通過染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq），首先通過ChIP-Seq分析這些增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)記分子在基因組上的富集情況，確定活性增強(qiáng)子位點(diǎn)。之后再對所有活性增強(qiáng)子進(jìn)行分析，鑒定得到超級增強(qiáng)子。通過與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可發(fā)現(xiàn)超級增強(qiáng)子所調(diào)控的靶基因。

2021年11月4日，武漢大學(xué)吳旻教授課題組在《Nat Commun》雜志發(fā)表了題為“Genome-wide profiling in colorectal cancer identifies PHF19 and TBC1D16 as oncogenic super enhancers”的研究論文，該研究通過分析結(jié)直腸癌（CRC）病人的腫瘤和癌旁組織的增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄組變化，鑒定出多種CRC相關(guān)增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄因子，為結(jié)直腸癌的研究提供了重要的表觀基因組資源和候選研究對象。

標(biāo)題：Genome-wide profiling in colorectal cancer identifies PHF19 and TBC1D16 as oncogenic super enhancers結(jié)直腸癌的全基因組分析鑒定出PHF19和TBC1D16是致癌的超級增強(qiáng)子

時(shí)間：2021.11.04

期刊：nature communications

影響因子：IF 17.694

技術(shù)平臺：ChIP-seq、全基因組測序、RNA-seq等

研究摘要：

結(jié)直腸癌（CRC）是最常見的癌癥之一。盡管CRC的基因組突變和單核苷酸多態(tài)性已被廣泛研究，但結(jié)直腸癌患者組織中的表觀基因組狀態(tài)仍不了解。

本研究將基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析相結(jié)合，對73對結(jié)腸直腸癌配對患者組織（同一患者的腫瘤和癌旁組織）在全基因組水平上進(jìn)行多組學(xué)測序，共產(chǎn)生147個(gè)H3K27ac的ChIP-Seq樣本、144個(gè)RNA-Seq樣本、147個(gè)全基因組測序樣本和86個(gè)H3K4me3 ChIP-Seq樣本。

分析鑒定出結(jié)直腸癌中5590個(gè)獲得的差異增強(qiáng)子位點(diǎn)(gain VELs)和1100個(gè)缺失的差異增強(qiáng)子位點(diǎn)(lost VELs)，334個(gè)獲得的差異超級增強(qiáng)子位點(diǎn)(gain VSELs)和121個(gè)缺失的差異超級增強(qiáng)子位點(diǎn)(lost VSELs)。

通過motif分析和核心調(diào)控回路分析預(yù)測結(jié)直腸癌中的多個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了調(diào)控PHF19和TBC1D16的超級增強(qiáng)子在調(diào)控結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生中的作用，鑒定出KLF3是結(jié)直腸癌的致癌轉(zhuǎn)錄因子。本研究為結(jié)直腸癌的表觀遺傳學(xué)研究提供了重要的表觀基因組資源和功能因子。

結(jié)果圖形

（1）結(jié)直腸癌患者組織中增強(qiáng)子分布的全基因組研究

圖1：CRC患者組織中活性增強(qiáng)子的注釋

1. 用于研究CRC患者的腫瘤組織和癌旁組織的增強(qiáng)子實(shí)驗(yàn)工作流程。

2. CRC患者腫瘤組織和癌旁組織中增強(qiáng)子元件的基因組分布。

3. 隨著腫瘤樣本數(shù)量增加，新獲得的增強(qiáng)子占總顯著增強(qiáng)子百分比的飽和度分析。

4. 比較腫瘤和癌旁組織的基因表達(dá)倍數(shù)變化（FC）和p.adj。紅點(diǎn)表示腫瘤上調(diào)基因，藍(lán)點(diǎn)表示癌旁組織上調(diào)基因，灰點(diǎn)表示基因未變化。

5. ChIP-seq和RNA-seq的Meta軌跡標(biāo)準(zhǔn)分析顯示MYC啟動子和增強(qiáng)子位點(diǎn)的H3K27ac和mRNA信號。

6. 將腫瘤樣本數(shù)據(jù)與20個(gè)COAD細(xì)胞系（GSE77737）之間增強(qiáng)子位點(diǎn)重疊分析。

7. 本研究鑒定的CRC中新增強(qiáng)子的百分比。

（2）腫瘤中變化的增強(qiáng)子位點(diǎn)鑒定

圖2：CRC中增強(qiáng)子位點(diǎn)變化鑒定

1. 所有腫瘤和癌旁組織中缺失和獲得差異增強(qiáng)子位點(diǎn)（gain VELs）的相對H3K27ac信號。

2. 達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的獲得和缺失VEL所需的復(fù)發(fā)率（p.adj<0.05）。左側(cè)兩條垂直虛線突出顯示當(dāng)達(dá)到顯著百分比的截止值（0.95，黑色虛線）時(shí)獲得和缺失VEL的復(fù)發(fā)百分比，右側(cè)兩條線分別突出顯示腫瘤或癌旁組織中獲得或缺失VEL的最高復(fù)發(fā)率。gain VEL，復(fù)發(fā)達(dá)到14時(shí)，顯著VEL百分比為95.635%；lost VEL，當(dāng)復(fù)發(fā)達(dá)到19時(shí)，顯著VEL百分比為96.273%。p.adj表示BH調(diào)整的t檢驗(yàn)p值。

3. IL20RA位點(diǎn)上代表性獲得的差異增強(qiáng)子位點(diǎn)（gain VEL）H3K27ac軌跡。

4. GREAT軟件（版本3.0.0）檢測的參與的人類疾病本體論分析。紅色條代表CRC相關(guān)疾病，黑色條代表其他疾病。

E-G. 對RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)鑒定的基因表達(dá)（E）、所有顯著增強(qiáng)子（F）和啟動子（G）信息對腫瘤和癌旁組織分類的PCA分析。

（3）CRC亞群的增強(qiáng)子特征

圖3：CMS亞群中增強(qiáng)子的特征

1. 四個(gè)CMS(consensus molecular subtypes)亞群成員的患者標(biāo)識符。

2. 使用R包CMScaller對CRC樣本進(jìn)行CMS分類。

3. CMS1-4亞組所有腫瘤樣本中g(shù)ain VEL區(qū)域與H3K27ac信號相關(guān)性。相關(guān)性通過Spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算。

4. CMS亞群中g(shù)ain VEL的所需復(fù)發(fā)率，以滿足不同截止值下的統(tǒng)計(jì)顯著性（p.adj<0.05）。

5. 四個(gè)CMS亞群中亞組顯著gain VEL的數(shù)量。

6. 四個(gè)CMS亞群中g(shù)ain VEL區(qū)域上的平均H3K27ac信號（RPM）。

7. 每個(gè)CMS亞群特異性gain VEL的數(shù)量。當(dāng)一個(gè)CMS亞組中一個(gè)VEL的平均RPM比其他三個(gè)高1.5倍時(shí)，確定亞組特異性gain VEL。

8. 基于GO（生物過程）和通路數(shù)據(jù)庫（Reactome）中注釋基因集的顯著重疊分析，對與CMS2特異性gain VEL相關(guān)的靶基因進(jìn)行功能注釋。

9. 四個(gè)CMS亞群中CEL和DPEP1基因位點(diǎn)歸一化H3K27ac的Meta軌跡。

（4）超級增強(qiáng)子位點(diǎn)的分析與驗(yàn)證

圖4：腫瘤特異性超級增強(qiáng)子在CRC中的作用

1. 與超級增強(qiáng)子（SE）相關(guān)的基因按復(fù)發(fā)率排序。紅點(diǎn)代表腫瘤特異性SE基因，藍(lán)點(diǎn)代表癌旁組織特異性SE基因。列出了前10個(gè)腫瘤和癌旁組織特異性基因。

2. 在腫瘤和癌旁組織中獲得的差異超級增強(qiáng)子位點(diǎn)（VSEL）的平均H3K27ac信號（RPM）。

3. 在腫瘤和癌旁組織中缺失的差異超級增強(qiáng)子位點(diǎn)（VSEL）的平均H3K27ac信號（RPM）。

4. IER3基因位點(diǎn)的Meta歸一化H3K27ac軌跡。頂部的綠色軌跡表示HCT116中的H3K27ac信號，底部的黑色和灰色線分別表示腫瘤和癌旁組織的平均信號。粉紅線表示dCas9-KRAB sgRNA靶點(diǎn)。

5. 對照組和sgRNA組中LIF、SLC7A5、CYP2S1、PHF19、RNF43、CEBPB、TBC1D16、TNFRSF6B、VEGFA和IER3的相對mRNA水平（n=3)條形圖，靶向EGFP的sgRNA對照在以下實(shí)驗(yàn)中用作對照*p<0.05。

6. 用圖5E中提到的增強(qiáng)子Cas9-KRAB sgRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞系的Transwell分析（n=3)。用表達(dá)所示sgRNA的HCT116穩(wěn)定細(xì)胞在裸鼠中進(jìn)行G-I異種移植實(shí)驗(yàn)。腫瘤圖像（G）、體積（H）和重量（I）。n=9（所有組別）。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM。使用雙側(cè)Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p值標(biāo)記在相應(yīng)項(xiàng)目上。

（5）功能轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測與驗(yàn)證

圖5：CRC中功能轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

1. 通過HOMER motif分析確定在腫瘤獲得水平的無核小體區(qū)域（NFR）內(nèi)富集的DNA motif。

2. 通過預(yù)測的核心調(diào)控回路分析腫瘤-癌旁組織的總程度（total degrees）排序轉(zhuǎn)錄因子熱圖。列出了前30個(gè)腫瘤和癌旁組織特異性TF。

3. 圖5B中列出的特定TF的總程度（腫瘤-癌旁組織）和表達(dá)FC（腫瘤/癌旁組織）。藍(lán)點(diǎn)代表前30個(gè)腫瘤特異性TF，紅點(diǎn)代表前30個(gè)癌旁組織特異性TF。圓圈大小表示TF在其特定組織中的平均表達(dá)（FPKM）。

D-E. KLF3敲除的HCT116細(xì)胞系Transwell分析。western blot檢測KLF3，p=1.06E-4（sgKLF3.1）和1.55E-4（sgKLF3.2）。n=3，數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。

F-H. 將KLF3通過sgRNA穩(wěn)定地敲除HCT116細(xì)胞注射到裸小鼠（10^6細(xì)胞梨小鼠，n=10)，腫瘤圖像（F）、腫瘤生長曲線（G）和體重（H）顯示為平均值（± SEM）。G中sgKLF3.1和KLF3.2的P值分別為0.0261和0.0296，H中sgKLF3.1和KLF3.2的P值分別為0.0256和0.0355。

結(jié)論：

本研究通過對結(jié)直腸癌組織（腫瘤組織和癌旁組織）進(jìn)行全基因組水平上的多組學(xué)測序（ChIP-seq、RNA-seq、全基因組測序），提供了結(jié)直腸癌臨床組織的全面的活性增強(qiáng)子圖譜，通過實(shí)驗(yàn)鑒定出10多個(gè)超級增強(qiáng)子在結(jié)直腸癌中的作用，發(fā)現(xiàn)調(diào)控PHF19和TBC1D16的超級增強(qiáng)子是致癌的超級增強(qiáng)子，揭示KLF3是一個(gè)新的結(jié)直腸癌的致癌轉(zhuǎn)錄因子，為結(jié)直腸癌的研究提供了重要的表觀基因組數(shù)據(jù)和新的關(guān)鍵調(diào)控因子。

關(guān)于易基因染色質(zhì)免疫共沉淀測序?(ChIP-seq)

染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典方法。將ChIP與高通量測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，可在全基因組范圍對特定蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行高效而準(zhǔn)確的篩選與鑒定，為研究的深入開展打下基礎(chǔ)。

DNA與蛋白質(zhì)的相互作用與基因的轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)的空間構(gòu)型和構(gòu)象密切相關(guān)。運(yùn)用組蛋白特定修飾的特異性抗體或DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子特異性抗體富集與其結(jié)合的DNA片段，并進(jìn)行純化和文庫構(gòu)建，然后進(jìn)行高通量測序，通過將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組精確比對，研究人員可獲得全基因組范圍內(nèi)某種修飾類型的特定組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子與基因組DNA序列之間的關(guān)系，也可對多個(gè)樣品進(jìn)行差異比較。

應(yīng)用方向：

ChIP 用來在空間上和時(shí)間上不同蛋白沿基因或基因組定位

• 轉(zhuǎn)錄因子和輔因子結(jié)合作用

• 復(fù)制因子和 DNA 修復(fù)蛋白

• 組蛋白修飾和變異組蛋白

技術(shù)優(yōu)勢：

• 物種范圍廣：細(xì)胞、動物組織、植物組織、細(xì)菌微生物多物種富集經(jīng)驗(yàn)；

• 微量建庫：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展開測序分析；

• 方案靈活：根據(jù)不同的項(xiàng)目需求，選擇不同的組蛋白修飾特異性抗體。

技術(shù)路線：

有ChIP-seq測序或組學(xué)研究需要的老師可聯(lián)系易基因。

參考文獻(xiàn)：

1. Li QL, et al. Genome-wide profiling in colorectal cancer identifies PHF19 and TBC1D16 as oncogenic super enhancers. Nat Commun. 2021 Nov 4;12(1):6407.

2. doi：10．11843／j．issn．0366－6964．2021．012．002

3. 武漢大學(xué)官網(wǎng)