二十多年前一種針對B細胞上表達的CD20的IgG單克隆抗體（mAb）——利妥昔單抗成功引入后，越來越多的癌癥治療IgG mAb投入臨床，并有效提高了患者的預期壽命。這些單克隆抗體多數(shù)是通過F（ab’）2結構域干擾靶功能，或通過C1q與腫瘤細胞表面聚集的Fc結構域結合后，誘導補體依賴性細胞毒性（CDC）直接發(fā)揮作用。除了CDC，IgG Fc結構域與免疫細胞上表達的Fcγ受體（FcγR）結合可引發(fā)抗體依賴性細胞介導的細胞毒性/吞噬（ADCC/P）作用。

目前所有用于癌癥的治療性mAb均基于IgG同種型。究其原因，主要是IgG廣泛存在于體內，且半衰期長，再加上人類對IgG同種型有大量基礎知識和生物技術知識的積累。攜帶FcR的免疫效應細胞通過與IgG調理腫瘤細胞的IgG Fc結構域結合，在癌癥治療的抗體療法中發(fā)揮著重要作用。由于這些治療劑基于IgG的形式，免疫細胞只能采用FcγR介導的ADCC、ADCP和/或ADCT機制。觸發(fā)ADCC/P的IgG mAb首先通過FcγRIIIa或者不同的激活FcγR激活NK細胞或單核/巨噬細胞。在細胞質結構域或通過FcR相關的γ鏈，經(jīng)ITAM（基于免疫受體酪氨酸的激活基序）激活FcR信號?？贵w與FcR交聯(lián)后，ITAM根據(jù)免疫細胞類型結合并激活Lyn/Fyn酪氨酸激酶。隨后，磷酸化的ITAM將募集和激活Syk，然后激活SOS、Ras、Rac、PKC、PI3K，最后是ERK或MAP激酶，誘導基因轉錄細胞因子、炎癥介質、殺菌酶、細胞骨架的激活，這些共同導致ADCC、吞噬作用、細胞遷移和脫粒。這些通路在不同的激活Fc受體和Ig同種型之間存在差異，最近研究發(fā)現(xiàn)其他同種型如IgA和IgE，也有望用于腫瘤治療。

IgA已被證明在體內對腫瘤細胞是有效的，IgA同種型可以通過單體IgA活化Fc受體（FcαRI），引發(fā)強大的抗腫瘤反應。IgA的腫瘤殺傷作用很大程度上取決于FcαRI（單體IgA的骨髓Fc受體）的存在。在表達FcαRI的先天免疫細胞中，中性粒細胞在消除IgA調理的腫瘤細胞方面特別活躍。中性粒細胞是體內最豐富的免疫細胞，占循環(huán)白細胞的70%；它們在體內遷移并監(jiān)視組織（包括惡性腫瘤），通過Trogoptosis效應機制導抗體誘導的抗腫瘤作用。受刺激的中性粒細胞在與抗體結合后觸發(fā)胞啃作用，引發(fā)調理細胞死亡，這個過程也被稱為ADCT（抗體依賴性細胞介導的胞啃作用）。為了研究IgA介導的中性粒細胞腫瘤殺傷作用的潛在機制。研究人員從51Cr釋放、活細胞成像、中性粒細胞上的定量FcR表達水平、FcR與IgG/IgA結合能力以及p-ERK動力學等幾個方面進行了分析。

結果

1. 與IgG相比，IgA介導的腫瘤細胞中性粒細胞毒性更強

與IgG相比，IgA調理的腫瘤細胞可以被新鮮分離的中性粒細胞有效殺死。研究人員使用三個靶標（CD20、HER2和EGFR）和從健康供體中新鮮分離的未受刺激的中性粒細胞進行了51Cr釋放測定（圖1）。在較寬的濃度范圍內滴定mAb，相似濃度下，IgA實現(xiàn)了最大裂解量（圖1A-C）。在每個靶點兩個細胞系的腫瘤細胞裂解實驗中，盡管實驗中mAb、細胞系及中性粒細胞供體各不相同，但IgA的表現(xiàn)始終優(yōu)于IgG（圖1D）。 2. IgA存在時中性粒細胞可迅速對IgA調理細胞做出反應 運用活細胞成像技術對抗體介導的中性粒細胞腫瘤殺傷過程進行了可視化分析。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞在抗HER2 IgA存在的情況下對A431-HER2調理細胞迅速作出反應，在抗HER2 IgG（曲妥珠單抗）存在的情況下，A431-HER2細胞不會引起中性粒細胞的明確募集，僅觀察到最小相互作用（圖1E）。在IgA存在的情況下，腫瘤細胞在30分鐘內死亡，如紅色熒光所示。EGFR和CD20的靶細胞成像實驗也觀察到相似的動力學現(xiàn)象?；罴毎上駥嶒炞C實了IgA在中性粒細胞介導的三種不同靶標的腫瘤細胞殺傷作用優(yōu)于IgG。

圖1：與IgG相比，IgA介導更高的人中性粒細胞腫瘤殺傷作用。（A-D）分離的人中性粒細胞（E:T = 40:1）通過4小時51Cr釋放試驗特異性溶解腫瘤細胞。CD20、HER2、EGFR抗體分別作用于Ramos和EL4-CD20、SK-BR-3和Ba/F3-HER2、A431和A1207細胞。（A-C）使用IgA和IgG抗體的寬滴定范圍特異性裂解指定的靶細胞。（D）除Ramos細胞（13.3μg/mL）和A1207細胞（1μg/mL）外，其余靶細胞IgG和IgA抗體的抗體濃度均為10μg/mL。Ctrl為無抗體狀態(tài)（0.001μg/mL CD20 IgG1抗體處理Ramos細胞）。一個圖表代表n = 4-6個不同健康供體的獨立實驗，p < 0.001: ***， p < 0.0001: ****，未配對t檢驗。（E）活細胞顯微鏡下黏附的A431-HER2細胞（鈣黃素標記）和中性粒細胞的靜態(tài)圖片，5μg/mL抗HER2 IgA2或IgG（曲妥珠單抗）和死細胞核染料TO-PRO-3（紅色熒光）存在，時間以分鐘為單位，每30秒采集一次圖像，持續(xù)1.5 h。

3. 中性粒細胞上的IgA受體FcαRI表達量顯著低于IgG受體FcγRIIa和FcγRIIIa

對FcγRIIIb的作用及其FcR表達水平的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞的FcαRI表達比FcγRIIa（中性粒細胞上的活化FcγR）低約2倍，GPI連接的FcγRIIIb的表達比FcγRIIa和FcαRI至少高10倍（圖2A）。盡管FcγRIIIb是一種GPI連接的蛋白質并且不能自行發(fā)出信號，但它會干擾Fc介導的作用。FcγRIIIb的大量表達可能通過阻止質膜上的最佳FcγRIIa組織來干擾高效ITAM信號通路和觸發(fā)中性粒細胞效應器功能。但在51Cr釋放試驗中，用3G8 mAb F（ab'）2阻斷FcγRIIIb，僅略微改善了IgG介導的腫瘤細胞裂解（圖2B），未能使IgG誘導的腫瘤細胞裂解恢復到IgA所達到的水平。

圖2：阻斷FcγRIIIb只能略微改善腫瘤細胞裂解。（A）流式細胞術（Qifikit）分析的FcγR和FcαRI在人類中性粒細胞上的定量表達，n=6-11名健康供體。（B）使用EL4-CD20與抗CD20 IgA2或IgG1（利妥昔單抗）、SK-BR-3與抗HER2I gA1或IgG1、A431與抗EGFR IgA2或IgG1進行3小時51Cr釋放測定，所有劑量均為10ug/毫升。在ADCC測定開始前15分鐘加入3G8 F（ab'）2片段（1ug/mL終濃度）。統(tǒng)計：Tukey多重比較檢驗的單因素方差分析，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.0001：****，Ctrl表示未添加抗體。

4. 中性粒細胞與IgA或IgG具有相似的結合特性 盡管與FcγR相比FcαRI的表達較低，但中性粒細胞與IgA結合表面的結合至少與IgG一樣好。單體IgA與FcαRI、單體IgG與FcγRIIa/FcγRIIIb的結合親和力處于低親和力范圍內，據(jù)報道Ka<107M-1，因此IgA/IgG與FcR的結合被認為是短暫的。僅當FcR與抗體結合表面多重相互作用的效價增加時，才能實現(xiàn)抗體與FcR的高親和力穩(wěn)定結合。來自健康供體的未受刺激原代中性粒細胞用鈣黃綠素標記，使其與包被在孔板上的抗體結合（圖3A-D）。多次洗滌后測量到中性粒細胞與HER2 IgA涂層的珠子結合更強（圖3A），但結果因供體/抗體靶標不同而異（圖3B、D）。對用CD20或HER2抗體包被的珠子進一步分析IgA顯示出更多聚集趨勢，因此與IgG相比，與IgA的結合更好，但未達到統(tǒng)計學意義（圖3F、G）。使用LigandTracer技術探索中性粒細胞與調理靶細胞的結合動力學。鈣黃綠素標記的原代中性粒細胞與抗CD20 IgA或IgG調理的Daudi細胞結合，如圖3H所示。在去除未結合的中性粒細胞后，及時進一步監(jiān)測剩余的中性粒細胞以研究中性粒細胞-Daudi相互作用的穩(wěn)定性。IgA和IgG介導的中性粒細胞結合之間無顯著差異（圖3I）。然而，當使用IgA時Daudi：neutrophil復合物的穩(wěn)定性增加（圖3J），但未達到顯著性。

圖3：中性粒細胞顯示出與IgA、IgG表面相似的結合特性。（A）供體的相對結合示例，其中鈣黃綠素標記的中性粒細胞與抗CD20 IgA2或IgG1（克隆UMAB001）包被的96孔板結合。在重復洗滌步驟后測量剩余的鈣黃綠素熒光。第一次洗滌前的鈣黃綠素熒光設置為100%。Ctrl表示在包被期間未使用抗體。（B-D）與A中一樣，但在洗滌10時，6-9個不同供體的數(shù)據(jù)被合并，每個目標是抗CD20 IgA2或IgG1（克隆UMAB001）或抗HER2 IgA2或IgG1。每種顏色表示來自同一捐贈者的數(shù)據(jù)。統(tǒng)計：Tukey多重比較檢驗的雙向ANOVA，p<0.0001：****。（E）中性粒細胞與白蛋白、抗CD20 IgA或IgG涂層珠子結合的示例圖像（珠子：中性粒細胞=5:1）。聚集的珠子被定義為結合5個或更多珠子的細胞。（F，G）用中性粒細胞定量抗CD20或抗HER2涂層珠子的聚集的珠子（顯示了n=3個單獨實驗）。根據(jù)Tukey多重比較檢驗的單向方差分析，差異不顯著。（H）鈣黃綠素標記的中性粒細胞與抗CD20 IgA-（紅色）或IgG-（黑色）調理過的Daudi細胞結合痕跡（n=5）。（I）綁定關聯(lián)，（J）來自5個不同供體的Daudi：中性粒細胞復合體的平均半衰期，統(tǒng)計：配對t檢驗。 5. IgA引發(fā)比IgG更強的ITAM信號傳導

中性粒細胞在FcR結合后發(fā)揮其效應功能，需要ITAM信號傳導。研究人員測量了與抗體包被表面結合后中性粒細胞中信號傳導的大小。免疫印跡分析顯示，當中性粒細胞與IgA包被的珠子相互作用5分鐘后，會出現(xiàn)快速而強烈的磷酸化ERK（p-ERK）信號，而IgG包被的珠子僅誘導微弱的p-ERK信號（圖4A-D）。使用不同供體的中性粒細胞，實驗結果一致。在51Cr釋放試驗中加入信號級聯(lián)中作用于ERK的上游的PI3K抑制劑wortmannin、Ly294002以及MEK1/2抑制劑U0126。這些藥理學抑制劑的存在導致腫瘤細胞裂解顯著減少（圖4E）。

圖4：中性粒細胞中由IgA引發(fā)的p-ERK信號強。（A，B）暴露于抗CD20或抗HER2I gA2或IgG1包被的Dynabeads后，中性粒細胞中p-ERK信號的隨著時間而變化。在破壞p-ERK或總ERK信號后，在同一印跡上進行肌動蛋白檢測。（C，D）信號量化定義為標準化p-ERK/肌動蛋白與標準化總ERK/肌動蛋白的比率。（E）4小時使用SK-BR-3和抗HER2 IgA2或IgG1進行51Cr釋放測定，兩者均為1ug/mL。信號因子的藥理學抑制劑wortmannin 0.5μM、Ly294002和U0126 20μM。統(tǒng)計：Tukey多重比較檢驗的雙向ANOVA p<0.05:*,p<0.01:**,p<0.001:***,p<0.0001:****。 6. IgA介導的中性粒細胞腫瘤殺傷模型 通過信號傳導的數(shù)量差異生成了一個模型，其中中性粒細胞中FcαRI信號傳導比FcγRIIa信號傳導更強，與IgG相比，IgA介導更強的中性粒細胞腫瘤殺傷作用（圖5）。中性粒細胞表達低親和力Fc受體FcγRIIIb、FcγRIIa和FcαRI。FcγRIIa和FcαRI都是激活Fc受體，因為在配體（抗體Fc結構域）結合、激酶（例如Lyn）聚集和募集時，它們通過其ITAM結構域發(fā)出信號并引發(fā)細胞效應器功能。中性粒細胞上相對較高的FcγRIIIb表達可能通過競爭Fc結構域結合和阻止脂質雙層內信號平臺/組織的正確形成來干擾FcγRIIa的激活能力。這導致FcγRIIa在中性粒細胞中無法啟動足夠的信號。盡管中性粒細胞上的FcαRI表達較低，但它們仍能與聚集的IgA Fc結構域結合，其程度與IgG Fc-FcγR相似。此外，IgA以雙價結合FcαRI，導致更穩(wěn)定的結合和4個ITAMs募集。這種情況將啟動激活效應器功能（包括消除腫瘤細胞的ADCT作用）所必需的強大ITAM信號傳導。在體外實驗中，信號通路抑制劑wortmannin、Ly294002和U0126可阻止腫瘤細胞的裂解，進一步說明了這一點。

圖5：IgA介導的中性粒細胞腫瘤殺傷模型。圖中問號是指涉及信號傳導、細胞內Ca2+、肌動蛋白-肌球蛋白收縮和免疫細胞-腫瘤細胞相互作用的尚不清楚的過程，這些過程會導致中性粒細胞的ADDC（trogoptosis）。

討論

以往研究表明，中性粒細胞介導的最大IgG殺傷通常比NK細胞介導的IgG殺傷更高。與IgA誘導的中性粒細胞裂解相比，IgG介導的NK細胞殺傷在較低抗體濃度下似乎更有效。體外實驗發(fā)現(xiàn)，對于三個靶點（CD20、EGFR和HER2），IgA同型在觸發(fā)未受刺激的中性粒細胞殺死腫瘤細胞方面比IgG更有效。Fc受體的表達、結合和信號轉導相關實驗表明，中性粒細胞上的FcαRI表達比Fcγ受體FcγRIIa低~2倍，比FcγRIIIb低~20倍，但IgA或IgG與中性粒細胞的結合依然相似。但與IgG相比，IgA介導的中性粒細胞結合更穩(wěn)定。通過p-ERK信號分子測定，發(fā)現(xiàn)中性粒細胞與IgA結合會引發(fā)比IgG更強的Fc受體信號。FcαRI參與時非常強的ITAM信號傳導解釋了IgA有效的中性粒細胞效應器功能。 中性粒細胞上FcαRI表達較低，但與IgG的相似結合及其強大的IgA誘導信號表明兩種同種型抗體FcR參與方式的根本差異。FcαRI能夠以1:1或2:1（FcαRI:IgA）的化學計量比與IgA相互作用（圖5）。FcαRI與IgA的二價結合會導致更強的結合，IgA介導的結合半衰期往往比IgG更長（圖3J）。此外，IgA與FcαR/FcRγ鏈復合物的化學計量更高，F(xiàn)cγRIIa只能通過位于其細胞質尾部的一個ITAM（基于免疫受體酪氨酸的激活基序）發(fā)出信號，而2:1化學計量的FcαRI會通過FcαRI相關的FcRγ鏈部署四個ITAM，從而產(chǎn)生更強的信號傳導（圖5）。加之結合高表達FcγRIIIb與FcγRIIa的競爭作用，導致IgA介導的中性粒細胞腫瘤殺傷作用比IgG更優(yōu)越。 雖然IgA癌癥治療尚未進入臨床試驗，但對于那些對IgG治療無反應或對IgG治療產(chǎn)生耐藥性的患者，IgA治療可能是一種有價值的補充或替代方案。中性粒細胞是體內最豐富的白細胞類型，加之IgA根據(jù)腫瘤類型和位置對中性粒細胞的嚴格激活可能讓IgA療法成為非常受歡迎的IgG替代方案。中性粒細胞向IgA調理腫瘤細胞的遷移類似于腫瘤細胞死亡之前的集群表型，它可能會破壞免疫耐受的腫瘤微環(huán)境并驅動強大的抗腫瘤反應。未來有望通過IgA調動大量中性粒細胞來根除體內腫瘤細胞，改進抗體療法。

參考文獻

Brandsma AM, Bondza S, Evers M, et al. Potent Fc Receptor Signaling by IgA Leads to Superior Killing of Cancer Cells by Neutrophils Compared to IgG[J]. Front Immunol, 2019,10.