生物大分子能否高效率地制備成功，關(guān)鍵在于分離純化方案的正確選擇和各個分離純化方法實驗條件的探索。選擇與探索的依據(jù)就是生物大分子與雜質(zhì)之間的生物學和物理化學性質(zhì)上的差異。由本章前述的生物大分子制備的各種特點可以看出，分離純化方案必然是千變?nèi)f化的。

? 制備生物大分子的方法可以粗略地分類如下：① 以分子大小和形態(tài)的差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。② 以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。③ 以電荷差異為依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子交換層析等。④ 以生物學功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析等。

應 用 范 圍

沉淀法

蛋白質(zhì)的沉淀作用操作簡便、成本低廉、對蛋白質(zhì)和酶有保護作用，重復性好 分辨力差，純化倍數(shù)低，蛋白質(zhì)沉淀中混雜大量鹽分蛋白質(zhì)和酶的

分級沉淀有機溶劑沉淀脫水作用和降低介電常數(shù) 操作簡便，分辨力較強? ?對蛋白質(zhì)或酶有變性作用，成本較高各種生物大分子的分級沉淀選擇性沉淀 等電點、熱變性、酸堿變性等沉淀作用選擇性較強，方法簡便，種類較多 應用范圍較窄 各種生物大分子的沉淀

結(jié)晶法 溶解度達到飽和，

溶質(zhì)形成規(guī)則晶體 純化效果較好，可除去微量雜質(zhì)，方法簡單 樣品的純度、濃度都要很高，時間長 蛋白質(zhì)或酶等吸附層析 化學、物理吸附 操作簡便 易受離子干擾 各種生物大分子的分離、脫色、和去熱源

離子交換層析 離子基團的交換 分辨力高，處理量較大 需酸堿處理樹脂平衡洗脫時間長 能帶電荷的生物大分子

凝膠過濾層析? 分子篩的排阻效應 分辨力高，不會引起變性 各種凝膠介質(zhì)昂貴，處理量有限制 分子量有明顯差別的可溶性生物大分子分配層析 溶質(zhì)在固定相和流動相中分配系數(shù)的差異 分辨力高，重復性較好，能分離微量物質(zhì) 影響因子多，上樣量太小 用于各種生物大分子的分析鑒定? ?

親和層析 生物大分子與配體之間有特殊親和力 分辨力很高 一種配體只能用于一種生物大分子，局限性大 各種生物大分子

聚焦層析 等電點和離子交換作用? ? ? 分辨力高 進口試制昂貴 蛋白質(zhì)和酶

固相酶法? 待分離物與固相載體之間有特異親和力? 分辨力高，用于連續(xù)生產(chǎn) 有局限性 抗體、抗原、酶和底 物等電聚焦連續(xù)電泳? 等電點的差異 分辨力很高 ，可連續(xù)制備 儀器試劑昂貴 蛋白質(zhì)和酶高速與超速離心? 沉降系數(shù)或密度的差異 操作方便，容量大 離心機設備昂貴 各種生物大分子超濾? 分子量大小的差異 操作方便，可連續(xù)生產(chǎn) 分辨力低，只能部分純化 各種生物大分子

制備HPLC 凝膠過濾、離子交換、反向色譜等 分辨力很高，直接制備出純品 制備柱和HPLC儀器昂貴? 各種生物大分子

? ?在分離純化流程中，早期和晚期的分離純化方法的選擇有明顯的不同：

? ⑴ 早期分離純化

1) 特點：①粗提取液中物質(zhì)成份十分復雜。②欲制備的生物大分子濃度很稀。

③物理化學性質(zhì)相近的物質(zhì)很多。④希望能除去大部分與目的產(chǎn)物物理化學性質(zhì)差異大的雜質(zhì)。

? 2) 對所選方法的要求：①要快速、粗放。②能較大地縮小體積。③分辨力不必太高。④負荷能力要大。

? 3) 可選用的方法：吸附；萃?。怀恋矸ǎ嶙冃?、鹽析、有機溶劑沉淀等）；離子交換（批量吸附、胖柱交換）；親和層析等。

? ⑵晚期分離純化? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ?1) 可選用的方法：吸附層析、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備HPLC等。

? ?2)要注意的一些問題：

? ?①鹽析后要及時脫鹽。

? ?②用凝膠過濾時如何縮小上樣體積，因為凝膠層析柱的上樣體積只能是柱床體積的1/10～1/6，也可以使用串聯(lián)柱以加大柱床體積。

? ?③必要時也可以重復使用同一種分離純化方法，例如分級有機溶劑沉淀，分級鹽析，連續(xù)兩次凝膠過濾或離子交換層析等。

? ?④分離純化步驟前后要有科學的安排和銜接，盡可能減少工序，提高效率。例如吸附不可以放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子交換要放在凝膠過濾之前，因為離子交換層析的上樣量可以不受限制，只要不超過柱交換容量即可。

? ?⑤分離純化后期，目的產(chǎn)物的純度和濃度都大大提高，此時對于很多敏感的酶極易變性失活，因此操作步驟要連續(xù)、緊湊，盡可能在低溫下（如在冷室中）進行。

? ?⑥得到最終產(chǎn)品后，必要時要立即冰凍干燥，分裝并寫明標簽，－20℃ 或

－70℃保存。