1．PARP介紹

維持基因組完整性對(duì)于正常細(xì)胞功能至關(guān)重要。在人類中，超過 150 種蛋白質(zhì)形成了一個(gè)復(fù)雜的 DNA 損傷反應(yīng) (DDR) 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)不斷發(fā)現(xiàn)和修復(fù) 損傷的DNA (1)。?
其中，PARP (Poly ADPRibose Polymerase) 蛋白家族由 17 個(gè)成員組成，它們催化蛋白質(zhì)的 ADP-核糖基化。PARP 涉及廣泛的生物學(xué)功能，包括修復(fù) DNA 損傷、維持基因組穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑、有絲分裂紡錘體組裝、RNA 周轉(zhuǎn)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)以及 DNA 甲基化等 (2)。?

盡管這些蛋白質(zhì)都屬于同一家族，但它們顯示出截然不同的特征。少數(shù) PARP 僅具有單核糖基化活性（MARylation），而其他 PARP 催化以線性或分支模式發(fā)生的多核糖基化（PARylation）（圖 1）。PARP 可能主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或兩者，并且在大小和結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，并包含多種多樣的功能域（圖 2）。值得注意的是，PARP5A 和 PARP5B 除了催化結(jié)構(gòu)域外只有一個(gè)大的錨蛋白結(jié)構(gòu)域（因此命名為端錨聚合酶 TNKS1 和 TNKS2，分別對(duì)應(yīng)于 PARP5A 和 B）。其他顯著特征包括 PARP1、PARP2 和 PARP3 的嚴(yán)格 DNA 依賴性，以及每種酶的底物特異性。?

正如許多具有重要作用的蛋白質(zhì)家族的情況一樣，PARP 蛋白質(zhì)在功能上有重疊。PARP1 和 PARP2 主要參與 DNA 修復(fù)，這兩種蛋白都調(diào)節(jié) DDR 網(wǎng)絡(luò)。PARP2 還調(diào)節(jié)表觀遺傳、增殖和炎癥過程，對(duì)精原細(xì)胞、胸腺和脂肪組織的發(fā)育很重要 (3, 4)。?
相反，當(dāng) DNA 受損無法修復(fù)時(shí)，PARP1 會(huì)改變轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它是受損 DNA 的第一反應(yīng)者，其重要性體現(xiàn)在其豐度上，因?yàn)樗亲畛Ｒ姷暮说鞍字弧?
DDR通路中的缺陷會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，進(jìn)而支持腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)和進(jìn)化，因?yàn)檫@些缺陷會(huì)導(dǎo)致突變積累。因此，當(dāng)DNA損傷修復(fù)和腫瘤抑制因子BRCA1或BRCA2（乳腺癌1/2型易感蛋白）發(fā)生突變時(shí)，會(huì)削弱細(xì)胞通過同源重組（HR）修復(fù)雙鏈DNA斷裂的能力，從而增加患上乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)(5)。
然而，喪失HR依賴性DNA修復(fù)系統(tǒng)意味著這些腫瘤細(xì)胞依賴于其他修復(fù)途徑來生存，從而暴露它們的治療致命弱點(diǎn)。實(shí)際上，人們對(duì)PARP作為治療靶點(diǎn)的興趣最初源于發(fā)現(xiàn)抑制PARP1/2可以殺死具有BRCA1或BRCA2突變的癌細(xì)胞。這一觀察首次證明了合成致死率的概念，即由于兩種蛋白質(zhì)同時(shí)破壞而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，這兩種蛋白質(zhì)在單獨(dú)受損時(shí)不會(huì)導(dǎo)致活力喪失。
目前已有幾種PARP抑制劑被批準(zhǔn)用于臨床，許多其他抑制劑也正在通過（前）臨床階段（3）。由于阻斷腫瘤細(xì)胞中的任何HR通路（不限于BRCA基因）都會(huì)產(chǎn)生"BRCAness"(6)，因此這種治療應(yīng)用也在不斷擴(kuò)大。然而，改進(jìn)現(xiàn)有抑制劑、靶向其他PARP家族成員并添加新的抑制劑以規(guī)避治療耐藥性仍然是癌癥藥物開發(fā)的重點(diǎn)(7)。

2．測(cè)定 PARP 酶活性

ADP-核糖基化是利用NAD+作為核糖供體，在蛋白質(zhì)底物中的Glu、Asp或Lys殘基的羧基上可逆地添加ADP核糖單元（如圖3所示）。為了測(cè)量PARP活性，需要使用PARP底物、NAD+、DNA依賴性PARP 1-3的DNA探針和純化的PARP酶。為確保檢測(cè)的靈敏度、穩(wěn)健性和可重復(fù)性，必須仔細(xì)優(yōu)化這些組件。以下幾點(diǎn)需要注意：?

• l? 蛋白質(zhì)必須具有酶促活性和純化，沒有會(huì)改變其活性的污染物。構(gòu)建帶有標(biāo)簽的重組蛋白有利于親和純化。

• l? 對(duì)于每個(gè)新批次的蛋白質(zhì)都應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)酶活性測(cè)試，以確保隨著時(shí)間的推移測(cè)定的一致性。

• l? 在測(cè)定開發(fā)階段，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)滴定，以確定每個(gè)PARP測(cè)定中使用的最佳濃度。

• l? 確定PARP1、PARP2和PARP3的最佳DNA探針可提高檢測(cè)特異性。

• l? 在基于標(biāo)記的NAD+檢測(cè)中，確定合適的NAD+混合物對(duì)于檢測(cè)的靈敏度至關(guān)重要。這必須為每種酶確定，以解釋單核糖基化或多核糖基化和酶動(dòng)力學(xué)。

在設(shè)計(jì)用于篩選大型化合物庫(kù)的測(cè)定時(shí)，通量、步驟數(shù)和低體積是關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)。但是，對(duì)于小型研究實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，總體分析成本或儀器可用性可能是最重要的方面。在選擇測(cè)定方法時(shí)時(shí)，需要考慮以下因素：
? 儀器可用性
? 使用方便程度
? 成本
? 靈敏度
? 通量
? 完成所需時(shí)間

3． 基于 ELISA 的酶促檢測(cè)
化學(xué)發(fā)光和比色測(cè)定試劑盒是基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）的，旨在測(cè)量藥物分析應(yīng)用中的PARP活性。在這些測(cè)定中，將底物蛋白包被在板上（見圖4），然后將生物素化的NAD+混合物與純化的PARP酶一起添加到優(yōu)化的測(cè)定緩沖液中。鏈霉親和素-HRP（辣根過氧化物酶）處理板后，添加適當(dāng)?shù)腍RP底物以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光或顏色，然后在每個(gè)步驟后清洗板。信號(hào)強(qiáng)度與附著在組蛋白上的生物素-NAD+的數(shù)量成正比。

考慮到PARP1和PARP2之間的高度同源性，很難找到對(duì)PARP1具有比對(duì)PARP2更好的親和力的藥物。這是理想的，因?yàn)镻ARP2的抑制會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的副作用(8)。為了減少脫靶活性，研究人員正在篩選靶向PARP1且親和力高于PARP2的分子。在一組比較AZD5305和Olaparib功效的實(shí)驗(yàn)中，BPS Bioscience的科學(xué)家能夠顯示出對(duì)PARP1和PARP2的獨(dú)特抑制作用。實(shí)際上，這兩種抑制劑對(duì)PARP1顯示出相似的IC50（7和8 nM）。在分析PARP2時(shí)，Olaparib的IC50為0.3 nM，而AZD5305的IC50為100 nM，證明了該分析的精確特異性和靈敏度。

4．AlphaLISA? 均相分析
AlphaLISA? 是一種基于微珠的免洗技術(shù)，由 PerkinElmer 開發(fā)，可用于定量蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合或新酶產(chǎn)物的測(cè)量。 AlphaLISA? PARP 均相檢測(cè)試劑盒采用高度特異性的 PAR 化底物抗體來識(shí)別 PARP 家族成員的酶活性。測(cè)定的特異性取決于純化蛋白的鑒定。

測(cè)定方案非常簡(jiǎn)單：首先將酶與生物素化底物孵育。然后添加受體珠和一抗，最后添加供體珠。這些免洗步驟之后直接讀取 Alpha 計(jì)數(shù)即可。需要注意的是，這些檢測(cè)需要使用專門的 AlphaScreen 酶標(biāo)儀。這種測(cè)定設(shè)計(jì)因其快速完成、高效和適合高通量應(yīng)用而備受青睞，例如篩選小分子文庫(kù)以識(shí)別新的 PARP 抑制劑。此外，它還可以用于準(zhǔn)確測(cè)量化合物的 EC50。

5. PARPtrapTM 檢測(cè)
當(dāng)受損的DNA結(jié)合PARP1和PARP2時(shí)，它們會(huì)將PAR鏈添加到它們自己的蛋白質(zhì)主鏈上(autoPARylation)，然后再添加到其他DDR蛋白質(zhì)上，以招募和激活它們(8)。PARylated的PARP1和PARP2隨后會(huì)從DNA上分離，以便其他PARylated的伙伴可以啟動(dòng)修復(fù)過程。目前已批準(zhǔn)的一些藥物通過與NAD+競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合催化位點(diǎn)，降低PARP1和PARP2的活性。如果沒有NAD+，PARP就無法進(jìn)行PARylation并保持與受損DNA的結(jié)合，使其免受其他DDR蛋白的影響。這會(huì)阻止DNA修復(fù)并增加細(xì)胞毒性，從而增強(qiáng)這些藥物的作用。因此，這類藥物的細(xì)胞毒性作用主要取決于它們將蛋白質(zhì)捕獲到受損DNA上的效率(9)，盡管科學(xué)家最近發(fā)現(xiàn)，使用PARP抑制劑將PARP1(而不是PARP2)捕獲到DNA會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加。因此，在篩選這些藥物時(shí)，應(yīng)包括量化PARP捕獲能力和區(qū)分抑制劑對(duì)PARP1或PARP2的選擇性的測(cè)定。

大多數(shù)商業(yè)上可用的PARP活性測(cè)定法量化目標(biāo)蛋白質(zhì)（例如組蛋白）的PARylation，并且一次僅測(cè)試一種PARP酶。相比之下，PARPtrap?組合檢測(cè)試劑盒用于PARP1和PARP2，可以比較同一檢測(cè)中分子捕獲PARP1和PARP2的能力。

該測(cè)定使用熒光標(biāo)記的DNA探針，根據(jù)PARP1或PARP2結(jié)合發(fā)射偏振光。當(dāng)PARP1或PARP2與DNA結(jié)合時(shí)，這些探針具有高熒光偏振(FP)。當(dāng)科學(xué)家將NAD+添加到檢測(cè)中時(shí)，PAR化酶從探針上分離，從而降低FP水平。相反，如果他們添加NAD+和PARP抑制劑，則抑制劑的捕獲能力會(huì)以劑量依賴的方式增加FP。

這種同質(zhì)、簡(jiǎn)單的測(cè)定法可以結(jié)合到高通量藥物發(fā)現(xiàn)篩選中，以篩選可增強(qiáng)DNA上PARP1或PARP2捕獲的分子。PARPtrap?檢測(cè)讓研究人員能夠高效地篩選他們的文庫(kù)，尋找最特異和最有效的抑制劑。

6. PROTAC? Optimization 試劑盒
靶向嵌合體或PROTAC的蛋白水解是一種新興的蛋白質(zhì)降解技術(shù)，它可以通過將感興趣的蛋白質(zhì)靶向泛素E3連接酶來促進(jìn)蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解。與傳統(tǒng)的小分子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)活性抑制相比，這項(xiàng)新技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
PROTAC分子由結(jié)合E3連接酶的配體組成，通過接頭連接到結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的配體。一旦形成這樣的復(fù)合物，它將被引導(dǎo)到蛋白酶體，從而促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的降解。與傳統(tǒng)的藥物相比，單個(gè)PROTAC可以促進(jìn)許多蛋白質(zhì)的降解，因?yàn)樗鼤?huì)在其目標(biāo)降解后被回收。
PROTAC的優(yōu)點(diǎn)在于可以對(duì)“難以藥物化”的蛋白質(zhì)進(jìn)行靶向，這使得它成為一種潛在的替代策略。任何感興趣的蛋白質(zhì)都可以使用這種技術(shù)作為目標(biāo)。但是，PROTAC的開發(fā)需要幾個(gè)優(yōu)化步驟，這些步驟因量化蛋白質(zhì)降解的技術(shù)難度而減慢。
PROTAC優(yōu)化分析通過直接測(cè)量PROTAC介導(dǎo)的復(fù)合物形成來繞過這些困難。這種方法能夠提供更準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果，從而加速PROTAC的開發(fā)和優(yōu)化過程。

測(cè)定原理：所測(cè)的PROTAC（這里是陽(yáng)性對(duì)照iRucaparib-AP6）與PARP1和CRBN相互作用，使它們靠近。PARP1含有一個(gè)被GSH供體珠識(shí)別的GST標(biāo)記，而CRBN含有一個(gè)與抗FLAG抗體結(jié)合的FLAG標(biāo)記的接受體珠。在激發(fā)供體珠后，供體珠會(huì)產(chǎn)生單線態(tài)氧。單線態(tài)氧會(huì)激發(fā)受體珠，并根據(jù)相互作用水平發(fā)射光。

7. 定制服務(wù)
BPS Bioscience提供靈敏、穩(wěn)健的檢測(cè)，可以在短時(shí)間內(nèi)提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，以滿足您的研究需求。我們支持比較藥物對(duì)所有 PARP 家族成員的 IC50 和篩選 PARP 捕獲藥物等研究。我們會(huì)及時(shí)提供協(xié)議、原始數(shù)據(jù)和分析數(shù)據(jù)，以確保您獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。我們的檢測(cè)廣泛涵蓋 PARP 酶組合，有助于進(jìn)行整個(gè) PARP 家族的化合物庫(kù)篩選、新檢測(cè)開發(fā)和優(yōu)化以及 IC50 測(cè)定等研究。除此之外，我們還提供獨(dú)特的 PARPtrapTM 分析，可專門評(píng)估藥物將 PARP1 或 PARP2 捕獲到 DNA 的效力。無論您的研究需求是什么，我們都能夠?yàn)槟峁┳顑?yōu)質(zhì)的服務(wù)。

應(yīng)用實(shí)例
Wang H. 等人發(fā)表的研究論文介紹了一種處于臨床開發(fā)階段的強(qiáng)效選擇性 PARP1/2 抑制劑 Pamiparib (BGB-290)。該藥物已在臨床前模型中證明具有 PARP-DNA 捕獲能力以及強(qiáng)大的抗腫瘤活性和 CNS 滲透能力。

本研究使用了每種化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的相應(yīng)檢測(cè)緩沖液和溶液，針對(duì)單個(gè) PARP 蛋白滴定 Pamiparib，包括 PARP1/2/3、PARP5A 和 PARP5B。此外，BPS Bioscience 還對(duì) PARP6、PARP7、PARP8、PARP10、PARP11 和 PARP12 進(jìn)行了測(cè)試。

結(jié)果顯示，Pamiparib 對(duì) PARP1 和 PARP2 的選擇性相等，EC50 分別為 1.3 nM 和 0.92 nM，對(duì) PARP3 的效力大約低 50 倍，并且對(duì)其他 PARP 家族成員表現(xiàn)出非常低的親和力。因此，Pamiparib 是一種有效的選擇性 PARP1 和 PARP2 抑制劑。

8. 配套產(chǎn)品
為了方便使用，我們提供了測(cè)定試劑盒成分的單獨(dú)購(gòu)買，包括底物和緩沖液。我們提供了約30種PARP抑制劑，可用作對(duì)照或優(yōu)化檢測(cè)。

此外，我們提供了一套包含八種PARP抑制劑的樣品，包括廣泛結(jié)合特異性的抑制劑，例如奧拉帕尼、尼拉帕尼、Rucaparib、他拉唑帕尼、維利帕尼。其中，AZD5305對(duì)PARP1具有特異性，XAV939對(duì)PARP5A和PARP5B具有特異性，而RBN-2397對(duì)PARP7具有特異性（PARP抑制劑組，BPS Bioscience #78318）。

9. 結(jié) 論
BPS Bioscience 提供PARP家族成員最多的選擇。我們提供純化的、帶標(biāo)簽的重組蛋白，這些蛋白具有酶促活性，適用于分析開發(fā)和抑制劑篩選或分析（例如，IC50 測(cè)定）。
我們還提供眾多的 PARP 檢測(cè)試劑盒和服務(wù)系列，包括獨(dú)特的 PARPtrap 檢測(cè)，有助于評(píng)估藥物的特異性和有效性，并可用于研究其作用機(jī)制。

人類PARP1結(jié)構(gòu)域（Zn1、Zn3、WGR、HD）與DNA雙鏈斷裂結(jié)合的結(jié)構(gòu)。PDB ID：7s81，Rouleau-Turcotte等人，Mol Cell（2022），PMID：35793673。使用BioRender.com創(chuàng)建。


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