期刊：Bioactive Materials (IF=16.874)

技術(shù)：3D培養(yǎng)；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

導(dǎo)讀

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）衍生的腎臟類器官?gòu)幕A(chǔ)疾病建模到個(gè)性化醫(yī)療具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，改進(jìn)控制腎臟類器官形成的生物物理和生化參數(shù)仍然是有必要的。本文使用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 比較 SAPH 內(nèi)成熟的類器官與生長(zhǎng)的類器官在 Matrigel 內(nèi)或氣液界面處的差異。總共分析了 13,179 個(gè)細(xì)胞，揭示了 14 個(gè)不同的簇。類器官成分分析顯示，Transwell 衍生的腎細(xì)胞類型比例更大，而 SAPH 衍生的類器官富含基質(zhì)相關(guān)細(xì)胞群。值得注意的是，較高 G' SAPH 內(nèi)的分化產(chǎn)生了具有更成熟基因表達(dá)譜的足細(xì)胞。此外，3D 微環(huán)境中的成熟顯著減少了雜細(xì)胞類型的衍生，這是當(dāng)前腎臟類器官的一個(gè)限制。這項(xiàng)工作證明了具有確定剛度的基于合成肽的水凝膠的效用，使腎臟類器官具有多種類型的微環(huán)境。

主要內(nèi)容

1.?Alpha4和Alpha5 SAPHs的力學(xué)特征

為了研究不同機(jī)械強(qiáng)度的SAPHs中腎臟類器官的分化，我們使用了兩種肽水凝膠；Alpha4（軟）和Alpha5（硬）。對(duì)兩種SAPHs的透射電鏡分析證實(shí)了含有富β-sheet納米纖維的ecm樣水凝膠微結(jié)構(gòu)（圖1A）。樣品暴露于基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基在與腎臟類器官分化方案中的培養(yǎng)基變化相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)被替換（圖1B）。在第0天，Alpha4的G‘為1050Pa，而Alpha5的G’顯著升高，在4310Pa，因此證實(shí)了Alpha5與Alpha4相比是一種更硬的水凝膠。有趣的是，當(dāng)暴露于基礎(chǔ)培養(yǎng)基+腎臟類器官時(shí)，Alpha4的G‘在15天的過(guò)程中增加到71393Pa（圖1C），而Alpha5的G’增加到16533Pa（圖1D）。

2.?SAPHs支持hipsc來(lái)源的腎臟類器官的生長(zhǎng)和分化

采用 Takasato protocol在SAPHs中生成腎臟類器官（圖2A）。首先，通過(guò)補(bǔ)充WNT信號(hào)激活因子CHIR99021，hiPSCs分化為單層，導(dǎo)致多能性標(biāo)記OCT4的丟失和原始條紋的誘導(dǎo)。在第3天，Brachyury (T)的表達(dá)證實(shí)了這一點(diǎn)（圖2B）。每個(gè)支持基質(zhì)總共評(píng)估了18個(gè)類器官（每個(gè)條件下有6個(gè)類器官，3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。隨后的定量結(jié)果顯示，兩種SAPH條件下產(chǎn)生的類器官都具有高度的活力，隨著基質(zhì)剛度的增加，細(xì)胞活力略有下降（基質(zhì)凝膠：92.47%，Alpha4：88.21%，Alpha5：84.25%）（圖2C）。類器官含有WT1+足細(xì)胞，導(dǎo)致LTL++近端小管，并由層粘連蛋白基底膜支撐。此外，LTL+近端小管細(xì)胞靠近+遠(yuǎn)端小管。管狀上皮內(nèi)腔區(qū)域?yàn)閆O-1+，標(biāo)志著這些結(jié)構(gòu)的上皮緊密連接。腎類器官內(nèi)的腎元結(jié)構(gòu)由MEIS1/2/3+ve間質(zhì)細(xì)胞支持。到第24天，H&E染色顯示整個(gè)SAPH衍生的類器官呈分散的管狀形態(tài)（圖2D）。對(duì)于近端小管，以LTL+-1+緊密連接標(biāo)記管腔，能夠攝取熒光標(biāo)記的葡聚糖（10000MW）（圖2 E）。

3. Alpha4、Alpha5、Transwell和Matrigel整合數(shù)據(jù)集的scRNA-seq突出了腎臟類器官中腎細(xì)胞類型的多樣性

為了進(jìn)一步描述水凝膠中產(chǎn)生的細(xì)胞類型，我們檢測(cè)了單細(xì)胞水平上的轉(zhuǎn)錄景觀。分化第24天，用機(jī)械和酶法將包裹在Alpha4、Alpha5和基質(zhì)凝膠中的類器官生成單細(xì)胞溶液。然后使用10x平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。此外，使用Harmony對(duì)Alpha4、Alpha5和基質(zhì)衍生的類器官進(jìn)行整合分析，基質(zhì)分化的類器官比較三維基質(zhì)生成的細(xì)胞類型和在氣液界面生長(zhǎng)的細(xì)胞類型。過(guò)濾去除應(yīng)激細(xì)胞后，共保留13179個(gè)細(xì)胞（Alpha4 3,946；阿爾法5 3,350；基質(zhì)凝膠1764；Transwell4119）用于分析。剔除線粒體基因和轉(zhuǎn)錄本數(shù)量大于25%的細(xì)胞。然后對(duì)合并的集成數(shù)據(jù)集進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類，然后對(duì)聚類進(jìn)行注釋，顯示14種不同的細(xì)胞類型，并使用統(tǒng)一流形近似和投影（UMAP）進(jìn)行可視化（圖3A）。使用集成的數(shù)據(jù)集，使在每種條件下具有相似基因表達(dá)譜的細(xì)胞類型適當(dāng)?shù)鼐奂谝黄稹＿@隨后促進(jìn)了簇內(nèi)細(xì)胞類型的比較和識(shí)別具有獨(dú)特基因表達(dá)特征的簇。通過(guò)將每個(gè)聚類的差異表達(dá)基因（DEGs）與文獻(xiàn)中已知細(xì)胞類型的標(biāo)記基因進(jìn)行比較，并與GUDMAP（https://www.gudmap.org/）中的數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，來(lái)確定每個(gè)聚類的細(xì)胞特性。每個(gè)群體中都有一個(gè)代表性標(biāo)記基因的小提琴圖（圖3B）。每個(gè)簇還顯示了5個(gè)最顯著的DEG的熱圖（圖3C）。采用層次聚類分析來(lái)研究生成的細(xì)胞類型之間的相似性（圖3D）。

4. scRNA-seq揭示了在不同的細(xì)胞外生長(zhǎng)環(huán)境中分化的腎臟類器官內(nèi)的細(xì)胞異質(zhì)性

一旦驗(yàn)證了不同條件下腎細(xì)胞類型的適當(dāng)分化，接下來(lái)的目標(biāo)是比較兩種合成肽水凝膠中產(chǎn)生的細(xì)胞群與基質(zhì)凝膠或Transwell插入物中形成的細(xì)胞群。通過(guò)類器官特性將整合的UMAP分離，并隨后對(duì)每個(gè)簇的組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)類器官生長(zhǎng)的細(xì)胞外環(huán)境對(duì)細(xì)胞群有顯著影響（圖4A和B）。然后將包含同一譜系的細(xì)胞類型的簇進(jìn)行分組，并檢查每個(gè)類器官的細(xì)胞類型組成（圖4C）。通過(guò)UMAP可視化了高度富集的脫靶神經(jīng)元基因的例子（圖4D）。進(jìn)一步比較細(xì)胞類型組成的百分比顯示，與Alpha4相比，Alpha5衍生的類器官的腎元形成增加（圖4C）。這反映在免疫熒光顯示的LTL+-LTL+近端小管的相對(duì)豐度上（圖4E）。transwell衍生的類器官透微鏡缺乏與成熟足細(xì)胞相關(guān)的結(jié)構(gòu)成分。相比之下，在支持基質(zhì)中分化的類器官具有具有更成熟的結(jié)構(gòu)特征的足細(xì)胞，包括初級(jí)和次級(jí)足突樣結(jié)構(gòu)（圖4F）。腎元祖細(xì)胞簇缺乏轉(zhuǎn)源性細(xì)胞，主要由Alpha5內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞類型組成。Alpha4和Alpha5顯示PITX2和SHISA2的表達(dá)增加（圖4G）。這些基因在腎元祖細(xì)胞誘導(dǎo)和自我更新中具有調(diào)節(jié)作用。近端前體簇在不同條件下表現(xiàn)出相似的基因表達(dá)譜，選擇性基因持續(xù)存在到足細(xì)胞/腎小管上皮簇中（圖4H）。跨孔來(lái)源的細(xì)胞組成了大多數(shù)足細(xì)胞/腎小管上皮簇，并顯示了豐富的腎元指定基因LHX1和LYPD1（圖4I）。每種情況下，未成熟足細(xì)胞標(biāo)記物FOXC2、PAX8和WT1的表達(dá)都相似（圖4J）。

參考文獻(xiàn)：

Niall J Treacy , Shane Clerkin, Jessica L Davis, et al.Growth and differentiation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived kidney organoids using fully synthetic peptide hydrogels[J].Bioact Mater. 2022 Aug 19;21:142-156.PMID: 36093324 PMCID: PMC9420433 DOI: 10.1016/j.bioactmat.2022.08.003