酵母雙雜交技術(shù)，自創(chuàng)建以來被廣泛應(yīng)用于蛋白互作研究領(lǐng)域，在生命科學(xué)的基礎(chǔ)探秘研究中起著重要作用。然而該技術(shù)設(shè)計初衷，僅是Stanley先生為了完成申請學(xué)校經(jīng)費(fèi)的目的。

該技術(shù)設(shè)計巧妙，它的許多優(yōu)點(diǎn)在設(shè)計之初并未顯現(xiàn)，反而在這么多年的高頻使用和進(jìn)一步開發(fā)利用過程中越發(fā)明顯。小歐簡單列舉一下（引用自Marc Vidal & Stanley Fields 的“The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years”）：

（1）盡管酵母雜交技術(shù)揭示了蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的詳細(xì)信息，但操作簡單。只需2個質(zhì)粒+1個菌株即可完成，且有不同體系方便選擇。
（2）該技術(shù)利用最佳的DNA結(jié)合位點(diǎn)，有效的激活結(jié)構(gòu)域和友好的報告基因系統(tǒng)，可以放大弱互作的信號。
（3）該技術(shù)可用于各種物種的蛋白互作檢測，具有物種普適性，尤其是人類蛋白。
（4）衍生技術(shù)具有更廣泛的應(yīng)用，可擴(kuò)展到檢測蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與RNA、蛋白質(zhì)與小分子以及其他組合之間的相互作用，甚至可實(shí)現(xiàn)將生理相互作用與表型數(shù)據(jù)直接關(guān)聯(lián)。

當(dāng)然，做過酵母雜交實(shí)驗(yàn)的小伙伴應(yīng)該都了解，互作結(jié)果的判斷，往往要等酵母生長好幾天才能看出來（當(dāng)然，小歐認(rèn)為這在偉大的科研事業(yè)過程中算不上啥），互作強(qiáng)弱也是主觀判斷性較強(qiáng)，存在假陽性?；诖?，有研（hao）究（shi）者為進(jìn)一步優(yōu)化酵母雜交實(shí)驗(yàn)體系，實(shí)現(xiàn)更客觀、快速的判斷蛋白互作強(qiáng)弱，降低假陽性及假陰性，對酵母雜交系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化改造，可實(shí)現(xiàn)不用涂板和固體培養(yǎng)就能客觀、定量的判斷蛋白互作程度?？靵砗托W一起看看靠譜不靠譜吧~

首先，文章標(biāo)題中的NanoLuc了解一下：NanoLuc是一種來源于深海蝦的小型分泌熒光素酶，其亮度是常用的螢火蟲和瑞尼拉熒光素酶的100倍；它的高穩(wěn)定性、低背景、寬閾值使其成為Y2H定量蛋白互作強(qiáng)弱的理想候選報告基因。

該研究中，用NanoLuc熒光素酶取代了BK100中的ADE2報告基因，得到了BK100Nano。當(dāng)?shù)鞍谆プ?，激活報告基因表達(dá)時，即能得到blingbling的酵母菌，改造原理示意圖如下：

圖1| Generation and characterization of BK100Nano. Integration strategy used to replace ADE2 in the GAL2-ADE2 locus of BK100 with NanoLuc luciferase (Nluc). Regions of homology are illustrated by shaded rectangles and dotted lines.

那么問題來了，如何來檢測發(fā)光信號呢？菌液要培養(yǎng)多久才能用于檢測？檢測酵母菌液的哪一部分呢？培養(yǎng)液？上清？菌體裂解液？發(fā)光值如何分析判斷？

研究者進(jìn)行了對比檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

①雖然酶解酶處理產(chǎn)生了最高的發(fā)光強(qiáng)度，但使用未處理的細(xì)胞培養(yǎng)物可以用更少的步驟獲得相同的信號/背景值（如圖2-A）（怎么選？相信你心里已經(jīng)有了答案~）；

②發(fā)光強(qiáng)度與菌液OD值存在線性關(guān)系，在測發(fā)光值前需要先測菌的OD值，以用于數(shù)據(jù)歸一；

③菌液樣品的培養(yǎng)時間及用量標(biāo)準(zhǔn)：綜合分析發(fā)現(xiàn)，將過夜菌液按照1:10稀釋后，再孵育3小時，然后測量發(fā)光活性條件最優(yōu)，效率最高；

④通過分析互作組與陰性對照組間發(fā)光值差異程度，可一定程度降低假陽性和假陰性。

圖2 | NanoLuc signal is detectable with whole cell cultures. (A) Comparison of luminescence intensity from untreated cells plus culture medium (Culture), culture supernatant (Sup), cells lysed with glass beads (Beads) and cells or supernatant following zymolyase treatment (Zymo, Z Sup). (B) Correlation between cell density and luminescence intensity.

當(dāng)然，小歐最關(guān)心的還是更換報告基因后，結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性。關(guān)于這方面，研究者設(shè)計了對比實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了可靠性驗(yàn)證（你猜結(jié)果準(zhǔn)確不準(zhǔn)確呢），順便給出了一個高通量檢測蛋白互作方法（即使用96孔板）。

具體如何進(jìn)行的呢？簡單概括一下就是，同時使用-His報告基因體系和NanoLucLuC體系，以同一個誘餌與74個互作蛋白進(jìn)行一對一驗(yàn)證，然后對兩種方法獲得的74對一對一驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)果檢測重疊性為91%。

圖3 | Comparison of positive interactions identified in NanoLuc assay and yeast two-hybrid growth assay. (A) Luminescence intensities of 74 human gene fragments identified for filovirus VP40 partners. Each human gene was tested against mVP40 and GFP as the negative control. B) Diploid yeast cultures were plated in parallel on S.D. -TL and -TLUH + 1mM 3AT and incubated for 3 and 6 days, respectively.

BTW，該研究中使用Synergy 4Multi-Detection Microplate Reader測定96孔板中菌液的OD值和發(fā)光值，下圖是小歐網(wǎng)上找到的Reader本機(jī)。

關(guān)于會發(fā)光的酵母雙雜交就介紹到這兒，最后留個問題，該研究中用于過夜搖菌的單克隆從何而來呢？知道的小伙伴可以在下方留言告訴小歐噢~

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