酵母單雜交（One-hybrid system，Y1H）:蛋白質(zhì)與DNA序列間相互作用關(guān)系

我們先來回顧一下酵母雙雜技術(shù)原理

如下圖為酵母雙雜原理圖：

? ? ?將Bait蛋白和Prey蛋白分別與轉(zhuǎn)錄因子GAL4的兩個結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)。如果Bait和Prey蛋白能結(jié)合，復(fù)合物就會依靠BD結(jié)構(gòu)域識別報告基因的上游結(jié)合序列，依靠AD結(jié)構(gòu)域，激活下游報告基因的表達(dá)。

UAS: Upstream Activation Sequence? 上游結(jié)合位點(diǎn)

對于酵母單雜：

酵母單雜交（One-hybrid system，Y1H）

酵母單雜交的檢測是基于獵物蛋白和誘餌DNA的相互作用。

誘餌序列位于報告基因的上游，可啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄

如上圖，簡單來說，酵母單雜需要將BaitDNA序列整合進(jìn)入酵母基因組中，將Prey蛋白構(gòu)建到AD載體中，與轉(zhuǎn)錄因子GAL4的AD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)。如果Prey蛋白能夠識別并結(jié)合BaitDNA序列，Prey蛋白所融合表達(dá)的AD結(jié)構(gòu)域就可以招募轉(zhuǎn)錄復(fù)合物以激活報告基因的表達(dá)。

在酵母單雜交實(shí)驗(yàn)中需要用到兩個載體??

載體1：誘餌載體?，它含有蛋白質(zhì)可以與之結(jié)合的誘餌DNA，需要整合到酵母基因組中

將選擇的目的基因（誘餌）整合到載體中，誘餌序列可以是啟動子、調(diào)控序列輔助元件或任何此類序列。

將誘餌載體整合入酵母基因組------產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報告株。

載體雖然整合到了酵母基因組中，但報告基因未表達(dá)。（我們需要AD轉(zhuǎn)錄激活域）

第二個載體為獵物載體，它包含編碼獵物蛋白的基因和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD。

這樣表達(dá)的蛋白是兩種基因的融合蛋白。該載體還含有標(biāo)記基因可用于篩選。

將獵物載體轉(zhuǎn)化到先前培養(yǎng)的酵母報告株中，轉(zhuǎn)化成功的酵母菌株可以在缺乏組氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上生長。

在酵母單雜交的檢測中，

如果獵物蛋白與誘餌序列相互作用，可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄，在篩選培養(yǎng)基上可觀察到陽性菌落。

如果獵物蛋白不與誘餌序列相互作用，則轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域無法激活RNA聚合酶啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。因此，在篩選培養(yǎng)基上無法觀察到陽性菌落。