HuH-7細(xì)胞的定義：

?HuH-7是一種人類(lèi)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，最初于1982年從一名56歲的日本男性的肝臟腫瘤中取出。HuH-7是成人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，已在以下領(lǐng)域中廣泛使用丙型肝炎和登革熱病毒研究，有時(shí)通過(guò)使用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)建CRISPR敲除細(xì)胞。近年來(lái)，出于研究目的，尤其是在涉及丙型肝炎基因敲除的研究中，HuH-7細(xì)胞主要在實(shí)驗(yàn)室中生長(zhǎng)。 Huh7細(xì)胞系的引入允許篩選針對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的丙型肝炎病毒的候選藥物，并允許開(kāi)發(fā)針對(duì)丙型肝炎的新藥物。

HuH-7是由上皮樣和致瘤細(xì)胞組成的永生細(xì)胞系。大多數(shù)的HuH-7細(xì)胞是高度異質(zhì)的，染色體數(shù)在55至63之間。這些細(xì)胞粘附在燒瓶或平板的表面。根據(jù)以前的研究，假設(shè)HuH-7細(xì)胞可以產(chǎn)生甲胎蛋白，胰酶α抗體，血漿銅藍(lán)蛋白，纖維蛋白原，纖連蛋白等。因此，基因編輯敲除細(xì)胞HuH-7在涉及相關(guān)研究的過(guò)程中會(huì)有所幫助這些蛋白質(zhì)。

基因編輯在HuH-7細(xì)胞系中的應(yīng)用：

1.HuH-7人肝細(xì)胞株中CYP3A5 * 3的CRISPR / Cas9遺傳修飾HuH-7細(xì)胞系衍生自肝癌，可以將細(xì)胞培養(yǎng)物中的底物MDZ轉(zhuǎn)化為其代謝產(chǎn)物。然而，HuH-7細(xì)胞在MDZ代謝方面不是很有效，因?yàn)樗鼈儗?duì)于慢速代謝CYP3A5 * 3等位基因是純合的。因此，需要開(kāi)發(fā)一種基因敲除和點(diǎn)突變肝細(xì)胞系，以模擬與細(xì)胞培養(yǎng)物中CYP3A5 * 1基因型相關(guān)的藥物快速代謝。研究人員假設(shè)，通過(guò)將HuH-7細(xì)胞系遺傳修飾為代謝活性更高的CYP3A5 * 1/*1或*1/*3基因型，這些細(xì)胞將具有增加的MDZ和Tac代謝活性。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，他們使用了CRISPR/Cas9生物工程技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)和表征新的細(xì)胞系，然后從表型上評(píng)估了基因型對(duì)MDZ和Tac代謝的影響。這些新改造的細(xì)胞可以在未來(lái)的研究中用作親本細(xì)胞系，以評(píng)估其他遺傳變異與藥物代謝和其他藥物代謝的關(guān)聯(lián)。

2.?HBV特異性gRNA和Cas9的共表達(dá)在體外抑制了HBV蛋白的產(chǎn)生

為了檢查聚簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR/Cas9系統(tǒng)是否可以切割HBV基因組，我們?cè)O(shè)計(jì)了8種針對(duì)A基因型HBV的gRNA。利用HBV特異性gRNA，CRISPR/Cas9系統(tǒng)顯著降低了HBV核心和表面的產(chǎn)生被HBV表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的HuH-7細(xì)胞中的蛋白，這產(chǎn)生了過(guò)表達(dá)的HuH-7細(xì)胞系。在八個(gè)篩選的gRNA中，鑒定出兩個(gè)有效的。有趣的是，靶向保守的HBV序列的一種gRNA對(duì)抗不同的基因型。使用流體動(dòng)力學(xué)-HBV持久性小鼠模型，研究人員進(jìn)一步證明了該系統(tǒng)可以裂解含肝內(nèi)HBV基因組的質(zhì)粒并促進(jìn)其在體內(nèi)的清除，從而降低血清表面抗原水平。這些數(shù)據(jù)表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可能在體外和體內(nèi)破壞表達(dá)HBV的模板，表明其在消除持久性HBV感染方面的潛力。

3.雙gRNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制乙型肝炎病毒復(fù)制

使用PCR和測(cè)序方法在與雙gRNA和HBV表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的HuH-7細(xì)胞中檢測(cè)HBV表達(dá)載體的破壞，并用KCl沉淀，PSAD消化，滾動(dòng)法檢測(cè)HepAD38細(xì)胞DNA的破壞。環(huán)擴(kuò)增和定量PCR相結(jié)合的方法。這些gRNA的細(xì)胞毒性通過(guò)線粒體四唑鎓測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效破壞HBV表達(dá)模板（基因型A-D），而沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。它可能是根除慢性HBV感染患者中持久性HBV DNA的潛在方法。

4.CRISPR/Cas9基因組編輯方法可作為對(duì)抗人類(lèi)病毒的武器

治愈慢性HBV感染需要從感染細(xì)胞中特異性清除持久性HBV DNA。Linetal（2014）設(shè)計(jì)了八種針對(duì)HBV的gRNA，顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)顯著降低了轉(zhuǎn)染了HBV表達(dá)載體的HuH-7細(xì)胞中HBV核心和HBsAg蛋白的產(chǎn)生。此外，該系統(tǒng)可以切割含有肝內(nèi)HBV基因組的質(zhì)粒，并在小鼠模型中促進(jìn)其體內(nèi)清除，從而導(dǎo)致血清HBsAg水平降低。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過(guò)瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促進(jìn)紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

源井生物根據(jù)客戶需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。