第3章 基因工程

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1、什么是基因工程：

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃?strong>DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫做DNA重組技術(shù)。

2、基因工程的誕生（三個(gè)理論和三個(gè)技術(shù)）：

基因工程是在生物化學(xué)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，正是這些學(xué)科的基礎(chǔ)理論和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程，具體有三大理論發(fā)現(xiàn)和三個(gè)技術(shù)突破。

1)?理論基礎(chǔ)：DNA是遺傳物質(zhì)；DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制；遺傳密碼的通用性和遺傳信息傳遞的方式；

2)?技術(shù)基礎(chǔ)：限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割；DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接；基因工程載體的構(gòu)建與應(yīng)用

• l理論上的三大發(fā)現(xiàn)

⑴、發(fā)現(xiàn)了遺傳物質(zhì)——DNA

1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

⑵、揭示了遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制：DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制

1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型、半保留復(fù)制圖，獲1958年諾貝爾獎(jiǎng)。

⑶、確立了遺傳信息的傳遞方式：以密碼形式傳遞

1963年，美國尼倫伯格（M.W.Nirenberg）和馬太（H.Matthaei）確立了遺傳信息以密碼形式傳遞，破譯了編碼氨基酸的遺傳密碼(3個(gè)核苷酸=1個(gè)密碼子=1個(gè)aa)。

• 技術(shù)上的三大突破

⑴、世界上第一個(gè)重組DNA實(shí)驗(yàn)：實(shí)現(xiàn)不同來源DNA的體外重組

1972年斯坦福大學(xué)化學(xué)家伯格（P.Berg）借助內(nèi)切酶和連接酶將猴病毒SV40的DNA和大腸桿菌λ噬菌體的DNA在試管中連接在了一起，第一次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的體外重組。

⑵、第一個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn)：重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)，是世界上第一個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn)

1973年美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)家科恩（S.Cohen）將體外構(gòu)建的含有四環(huán)素和卡那霉素抗性基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，獲得了具有雙抗性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，成功完成了第一個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn)。是基因工程誕生的標(biāo)志。

⑶、第一個(gè)真核基因在原核生物中的表達(dá)：第一次實(shí)現(xiàn)了異源真核基因在原核生物中的表達(dá)

1974年，科恩（S.Cohen）和博耶（H.Boyer）將非洲爪蟾編碼核糖體基因的DNA片斷同pSC101質(zhì)粒重組，并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，結(jié)果表明動(dòng)物基因已進(jìn)入大腸桿菌并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA產(chǎn)物，第一次實(shí)現(xiàn)了異源真核基因在原核生物中的表達(dá)。

1.1 重組DNA技術(shù)的基本工具

一、DNA基因工程的基本工具

DNA基因工程至少需要三種工具：

• “分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）

• ?“分子縫合針”——DNA連接酶

• ?“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

1、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）

（1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。

（2）功能：能識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。

（3）結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：粘性末端和平末端。

2、“分子縫合針”——DNA連接酶

(1)兩種DNA連接酶（E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶）的比較：

①相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵。

②區(qū)別：E·coli DNA連接酶來源于T4噬菌體，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。

(2)??與DNA聚合酶作用的異同：----------------------DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。

(3)??DNA 連接酶——“分子縫合針”

1. 作用: 將雙鏈 DNA 片段“縫合” 起來, 恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

2. 種類:

3、“分子運(yùn)輸車”——載體

（1）載體具備的條件：①能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。

②具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入。

③具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。

（2）最常用的載體是--質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

（3）其它載體： 噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒

4.DNA 的粗提取與鑒定

1. 實(shí)驗(yàn)原理:

(1) DNA、 RNA、 蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面有差異, 選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對它們進(jìn)行提取。

①DNA 不溶于酒精, 某些蛋白質(zhì)溶于酒精, 分離 DNA 和蛋白質(zhì)。

②DNA 能溶于 2mol/L 的 NaCl 溶液。

(2) DNA 遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。

2. 方法步驟:

(1) 研磨:取 30g 洋蔥切碎, 倒入 10 mL 研磨液研磨。

(2) 除雜: 漏斗中墊上紗布過濾后, 在 4 ℃冰箱靜置后取上清液, 1 500 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心后

取上清液。

(3) 提取: 加入體積相等、 體積分?jǐn)?shù) 95%酒精, 溶液出現(xiàn)白色的絲狀物是 DNA。

方法一: 用玻璃杯按一個(gè)(填“一個(gè)” 或“兩個(gè)” ) 方向攪拌, 卷起絲狀物, 用濾紙吸去上面的水

分。

方法二: 10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心 5 min, 取沉淀物晾干。

(4)鑒定:

DNA 的鑒定和還原糖的鑒定都需要加熱, 它們有什么不同?

提示:還原糖加斐林試劑后, 置于 55～65 ℃熱水中加熱; 而 DNA 加二苯胺試劑后, 置于沸水中加熱。

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1.2 基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定。

第一步：目的基因的獲取

1.目的基因是指： 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 。

2.原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法

3.PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

（1）原理：DNA雙鏈復(fù)制

（2）過程：a：加熱至90-95℃DNA解鏈；b：冷卻到55-60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；c：加熱至70-75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。

第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1.目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

2.組成：目的基因＋啟動(dòng)子＋終止子＋標(biāo)記基因

（1）啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。

（2）終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段 ，位于基因的尾端。

（3）標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。

第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞_

1.轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。

2.常用的轉(zhuǎn)化方法：

將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的方法是 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有 基因槍法和 花粉管通道法等。

將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是 顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是 受精卵。

將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：

3.重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。

第四步：目的基因的檢測和表達(dá)

1.首先要檢測 轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子雜交技術(shù)。

2.其次還要檢測 目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，方法是采用 用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。

3.最后檢測 目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取 蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的 抗體進(jìn)行?抗原－抗體雜交。

4.有時(shí)還需進(jìn)行 個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如 轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。

1.3 基因工程的應(yīng)用

1. 植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。

2. 動(dòng)物基因工程：提高動(dòng)物生長速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物。

3. 基因治療：把正常的外源基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮作用。

4、 基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用

1. 發(fā)展:

(1) 農(nóng)牧業(yè):1996-2017 年, 全世界轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增加了一百多倍, 美國是世界上轉(zhuǎn)基

因作物種植面積最大的國家。 2017 年, 我國轉(zhuǎn)基因作物種植面積居世界第八位。

(2) 動(dòng)物: 第一種用于食用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物——轉(zhuǎn)基因大西洋鮭在美國獲得批準(zhǔn)上市。

2. 實(shí)例:

連一連: 基于基因工程在改良動(dòng)植物品種、 提高作物和畜產(chǎn)品的產(chǎn)量等方面的應(yīng)用, 將下列轉(zhuǎn)

基因生物和選用的目的基因連線

5、 基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用

1. 生產(chǎn)藥物:

(1) 常見的藥物:細(xì)胞因子、 抗體、 疫苗和激素等。 我國生

產(chǎn)的重組人干擾素、 血小板生成素、 促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞集落刺激因子等基因工程藥物

均已投放市場。

(2) 批量生產(chǎn)藥物:乳腺(房) 生物反應(yīng)器。

①目的基因:藥用蛋白基因。

②啟動(dòng)子:乳腺中特異性表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。

③受體細(xì)胞:受精卵。

2. 移植器官: 在器官供體的基因組中導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子, 以抑制抗原決定基因的表達(dá), 或設(shè)法

除去抗原決定基因, 培育出不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。

培養(yǎng)乳腺生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)為什么要選用乳腺中特異性表達(dá)的基因的啟動(dòng)子?

提示:乳腺生物反應(yīng)器通過分泌的乳汁提取相應(yīng)的基因表達(dá)的產(chǎn)品, 乳腺中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子可讓目的基因在乳腺細(xì)胞中表達(dá)。

6、基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用

1. 氨基酸: 利用轉(zhuǎn)基因生物合成阿斯巴甜的原料——天冬氨酸和苯丙氨酸。

2. 酶: 利用轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)奶酪的凝乳酶; 利用轉(zhuǎn)基因生物加工轉(zhuǎn)化糖漿的淀粉酶; 利用轉(zhuǎn)基因生物加工烘烤食品、 制造生物能源的脂酶等。

3. 維生素。

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1.4 蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)工程的概念

蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。

基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)

2、 蛋白質(zhì)工程崛起的緣由

1. 基因工程的實(shí)質(zhì)和不足:

(1) 實(shí)質(zhì): 將一種生物的基因轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi), 后者可以產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì), 進(jìn)

而表現(xiàn)出新的性狀。

(2) 基因工程存在的不足:原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。

2. 蛋白質(zhì)工程的崛起:

(1) 理論和技術(shù)條件:分子生物學(xué)、 晶體學(xué)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展。

(2) 天然蛋白質(zhì)存在不足:天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要, 卻不一定完全

符合人類生產(chǎn)和生活的需要。

(3) 實(shí)例:

3、蛋白質(zhì)工程的基本原理：

它可以根據(jù)人的需求來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，又稱為第二代的基因工程。

基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推測應(yīng)有的氨基酸序列，找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白質(zhì)工程特有的途徑；以下按照基因工程的一般步驟進(jìn)行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）

設(shè)計(jì)中的困難：如何推測非編碼區(qū)以及內(nèi)含子的脫氧核苷酸序列

細(xì)胞工程：是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過細(xì)胞水平或細(xì)胞器水平上的操作，按著人的意志來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)。

根據(jù)操作對象的不同，可以分為植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程兩大領(lǐng)域。

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4、 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用

1. 醫(yī)藥工業(yè)方面:

(1) 速效胰島素類似物: 改變氨基酸序列, 抑制胰島素的聚合。

(2) 干擾素:一個(gè)半胱氨酸替換為絲氨酸, 延長保存時(shí)間。

(3) 單克隆抗體:將小鼠抗體上結(jié)合抗原的區(qū)域“嫁接” 到人的抗體上, 降低誘發(fā)免疫反應(yīng)的強(qiáng)

度。

2. 其他工業(yè)方面: 廣泛用于改進(jìn)酶的性能或開發(fā)新的工業(yè)用酶。 如枯草桿菌蛋白酶。

3. 農(nóng)業(yè)方面:

(1) 改造某些參與調(diào)控光合作用的酶, 提高植物光合作用的效率。

(2) 改造微生物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu), 增強(qiáng)防治病蟲害的效果。

【特別提醒】

有關(guān)蛋白質(zhì)工程的兩點(diǎn)提醒

(1) 改造對象是基因:任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的, 改造了基因即對蛋白質(zhì)進(jìn)行了

改造, 而且改造過的蛋白質(zhì)可以遺傳下去。

(2) 基因突變的新基因中含有不編碼蛋白質(zhì)的序列, 而蛋白質(zhì)工程中的新基因則沒有。