??前面小恒用了幾期干貨分別介紹了免疫沉淀及相關(guān)技術(shù)，包括免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、RNA免疫共沉淀（RIP），這些都是用于分析細(xì)胞內(nèi)蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA互作的經(jīng)典技術(shù)方法，以抗原—抗體之間特異性結(jié)合為基本原理實(shí)現(xiàn)的技術(shù)。另一種類似的蛋白互作的研究方法—pull-down實(shí)驗(yàn)，即拉下實(shí)驗(yàn)，也稱為體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，可以確定已知蛋白和未知蛋白間的互作關(guān)系。這兩種技術(shù)均能檢測(cè)蛋白間的相互作用且都是定性分析，沒法確定瞬時(shí)互作情況，從原理到應(yīng)用、以及實(shí)驗(yàn)上都存在一些區(qū)別。下面給大家具體介紹一下pull-down實(shí)驗(yàn)，以及相關(guān)的延申技術(shù)—DNA pull-down和RNA pull-down。

Pull-down實(shí)驗(yàn)基本原理

?????? Pull-down通過將已知蛋白作為誘餌蛋白，用生物素-、PolyHis-或GST-等標(biāo)簽對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，然后將誘餌蛋白固定在與其親和的固相支持物上充當(dāng)誘餌，與蛋白樣品或細(xì)胞/組織裂解液共孵育，可捕獲樣品中與誘餌蛋白互作的蛋白，接著通過洗滌或洗脫過程去除其余物質(zhì)，并將捕獲的蛋白回收，進(jìn)行WB或質(zhì)譜等檢測(cè)分析。其中誘餌蛋白和目的蛋白的獲取方法相對(duì)簡單，均可通過裂解細(xì)胞、純化蛋白、表達(dá)系統(tǒng)或體外轉(zhuǎn)錄/翻譯等方法獲得。

為了使pull-down技術(shù)更高效且易于應(yīng)用，研究人員將待捕獲的目的蛋白與特定的蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)，而誘餌蛋白則可以與標(biāo)簽結(jié)合，進(jìn)而捕獲目的蛋白，目前pull-down中應(yīng)用最為廣泛的融合標(biāo)簽是GST（glutathione-S-transferase，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶），此外6×His標(biāo)簽等也可以。為了方便后續(xù)檢測(cè)鑒定，待捕獲蛋白也可以融合Flag、HA或Myc標(biāo)簽，通過檢測(cè)標(biāo)簽反映捕獲蛋白的情況。

GST pull-down

?????? 基于GST融合蛋白發(fā)展起來的pull-down技術(shù)稱為GST pull-down，這得益于Smith團(tuán)隊(duì)在1988年從細(xì)菌中純化出GST融合蛋白，之后逐漸發(fā)展為如今研究蛋白互作最常用到的方法之一。GST可以與GSH（谷胱甘肽）結(jié)合。GST pull-down的基本原理是將GST融合蛋白作為誘餌蛋白，可與固定在固相支持物上的GSH結(jié)合，當(dāng)把目的蛋白樣品經(jīng)過時(shí)，即可得到與誘餌蛋白互作的目的蛋白。再通過分離洗脫結(jié)合物，進(jìn)行WB分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的互作關(guān)系或純化出相應(yīng)的目的蛋白。GST pull-down技術(shù)的應(yīng)用主要包括兩個(gè)方面，一個(gè)是與WB實(shí)驗(yàn)結(jié)合驗(yàn)證兩種已知蛋白的直接互作關(guān)系，另一個(gè)是與質(zhì)譜結(jié)合尋找可能與已知蛋白存在相互作用的未知靶蛋白。

GST pull-down一般實(shí)驗(yàn)流程

（1）體外表達(dá)GST融合蛋白；

（2）純化GST融合蛋白，并固相化；

（3）制備待捕獲蛋白，可以融合His標(biāo)簽進(jìn)行原核表達(dá)，也可融合Flag/HA/Myc等標(biāo)簽進(jìn)行真核表達(dá)。若是未知蛋白，直接使用細(xì)胞裂解液即可。

（4）pull-down實(shí)驗(yàn)，即將蛋白樣本與固相化的GST融合蛋白共孵育；

（5）洗滌除去未結(jié)合蛋白等其它物質(zhì)，洗脫目的蛋白；

（6）WB鑒定或SDS－PAGE電泳后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

DNA pull-down

DNA pull-down技術(shù)是一種研究體外DNA與蛋白互作的有效方法。與pull-down不同的是，這項(xiàng)技術(shù)是以特定DNA序列作為探針，研究或?qū)ふ遗c之相結(jié)合的蛋白，常應(yīng)用于檢測(cè)鑒定轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白等。通常將DNA探針與生物素偶聯(lián)，生物素與鏈霉親和素間以高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合，可將DNA探針固定，以便捕獲互作蛋白。

DNA pull-down一般實(shí)驗(yàn)流程

（1）設(shè)計(jì)并制備DNA探針及標(biāo)記：以基因組特定DNA序列作為模板，可通過化學(xué)合成或PCR擴(kuò)增等方法獲得，然后使用生物素等標(biāo)記物對(duì)DNA探針進(jìn)行修飾。

（2）將DNA探針固定到固相支持物上，常見的有結(jié)合有鏈霉親和素的磁珠或瓊脂糖珠。

（3）表達(dá)/提取目的蛋白或蛋白樣品，樣品可以是細(xì)胞/組織裂解液、純化的蛋白。

（4）DNA pull-down，將蛋白樣品與固定的DNA探針一起孵育。

（5）洗滌除去非結(jié)合蛋白，分離純化目的蛋白。

（6）目的蛋白的檢測(cè)分析，如WB和質(zhì)譜。

RNA pull-down

?????? RNA pull-down技術(shù)則是研究RNA與RNA結(jié)合蛋白（RBP）間互作的主要方法之一。RNA與RBP的互作是基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)的重要一環(huán)，在生理和病理過程中都扮演者重要角色。同樣的，RNA pull-down以RNA探針作為誘餌去捕獲RBP，進(jìn)而對(duì)RBP進(jìn)行鑒定，或?qū)ふ椅粗腞BP。

?????? RNA pull-down的基本原理是通過體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得生物素標(biāo)記的RNA探針，然后與蛋白樣品共孵育，形成RNA-蛋白復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，通過生物素與鏈霉親和素的非共價(jià)親和作用，使其與孵育液中的其他物質(zhì)分離。得到的RBP是已知的情況下，通過WB檢測(cè)RBP與RNA的互作關(guān)系；若是未知的RBP，則結(jié)合質(zhì)譜對(duì)結(jié)合的未知RBP進(jìn)行鑒定分析。

RNA pull-down一般實(shí)驗(yàn)流程

?????? RNA pull-down的實(shí)驗(yàn)流程與DNA pull-down差不多，主要區(qū)別于探針的獲取方法：

（1）制備特定RNA探針并做生物素標(biāo)記，通RNA探針過體外轉(zhuǎn)錄方法制備。

（2）RNA探針固相化。

（3）獲取蛋白樣本，并與固定的RNA探針孵育。

（4）洗脫分離RBP。

（5）對(duì)RBP進(jìn)行WB或質(zhì)譜分析。

Pull-down相關(guān)技術(shù)與免疫沉淀相關(guān)技術(shù)的區(qū)別

綜合前幾期內(nèi)容和本文介紹的pull-down實(shí)驗(yàn)，它們存在一定的區(qū)別，主要包括以下幾個(gè)方面：

（1）免疫沉淀及相關(guān)技術(shù)可用于檢測(cè)研究體內(nèi)蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA之間的互作，可真實(shí)、完整地反映它們之間的互作關(guān)系；而pull-down及相關(guān)技術(shù)則反映是在體外結(jié)合狀態(tài)而不是體內(nèi)自然結(jié)合的狀態(tài)，無法得知真實(shí)的蛋白互作情況，因此可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

（2）免疫沉淀及相關(guān)技術(shù)得到的蛋白復(fù)合物可能存在一些非特異性黏附蛋白，因此不能直接證明蛋白間的直接互作關(guān)系，也可能是間接的結(jié)合的；pull-down可以排除其它蛋白的影響，直接反映目的蛋白和待檢測(cè)蛋白是否直接發(fā)生相互作用。

（3）還有一點(diǎn)是，pull-down可以作為免疫共沉淀的進(jìn)一步驗(yàn)證方法，判斷蛋白間是直接或作還是間接互作。

大家選擇實(shí)驗(yàn)方法時(shí)要注意不同方法有不同的應(yīng)用范圍，論證的結(jié)果也不同，因此要對(duì)一些相似的研究方法進(jìn)行區(qū)分，希望這幾期內(nèi)容能對(duì)大家有所幫助。至此，免疫沉淀和與其類似的pull-down技術(shù)就介紹差不多了，下期咱們?cè)倭牧倪@些實(shí)驗(yàn)中所使用的抗體，這也是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之處，歡迎繼續(xù)關(guān)注。漢恒生物專注病毒包裝十余年，有豐富的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)，有多種蛋白標(biāo)簽可供選擇，以滿足不同實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)簽使用的需求，如有產(chǎn)品需求或技術(shù)問題，歡迎聯(lián)系咨詢~