在解釋 qPCR 的工作原理之前，我們想簡(jiǎn)要概述一下它與標(biāo)準(zhǔn) PCR 和 RT-PCR 的區(qū)別。

標(biāo)準(zhǔn) PCR 在反應(yīng)完成后監(jiān)測(cè) DNA 擴(kuò)增，而 qPCR 使用熒光信號(hào)在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)監(jiān)測(cè) DNA 擴(kuò)增。 這就是為什么 qPCR 也稱為實(shí)時(shí) PCR、定量 PCR 或定量實(shí)時(shí) PCR。

RT-PCR，不要與實(shí)時(shí) PCR 混淆，代表逆轉(zhuǎn)錄 PCR，可用于擴(kuò)增 RNA 目標(biāo)序列。 它涉及在擴(kuò)增前將樣品 RNA 與逆轉(zhuǎn)錄酶和 DNA 引物進(jìn)行初始孵育。

qPCR 的工作原理

qPCR 依靠來(lái)自嵌入染料或水解探針的熒光來(lái)測(cè)量每個(gè)熱循環(huán)后的 DNA 擴(kuò)增。 最常見的基于染料的方法是 SYBR Green，最常見的基于探針的方法是 TaqMan。

SYBR Green qPCR

與標(biāo)準(zhǔn) PCR 一樣，SYBR Green 方案由變性、退火和延伸階段組成。 不同之處在于，您在 qPCR 設(shè)置期間將一些雙鏈 DNA 結(jié)合染料 SYBR Green I 添加到預(yù)混液中。 這種熒光染料在延伸階段嵌入到雙鏈 DNA 序列中，顯示出熒光信號(hào)的強(qiáng)烈增加。 在每個(gè)熱循環(huán)結(jié)束時(shí)測(cè)量此信號(hào)將使您能夠確定存在的雙鏈 DNA 的數(shù)量。

SYBR Green 檢測(cè)的缺點(diǎn)是染料會(huì)與任何雙鏈 DNA 序列結(jié)合。 這意味著您還可以檢測(cè)非特異性 qPCR 產(chǎn)物（例如引物二聚體）發(fā)出的熒光。 為消除這種風(fēng)險(xiǎn)，通過執(zhí)行熔解曲線分析檢查反應(yīng)特異性，或使用 TaqMan 方法。

TaqMan qPCR

該測(cè)定不使用嵌入染料，而是使用帶有 5' 熒光報(bào)告染料和 3' 淬滅染料的 TaqMan 探針。 這些探針是目標(biāo)特異性的，并且在退火步驟中僅與引物之一下游的目標(biāo) DNA 序列結(jié)合。 當(dāng) Taq 聚合酶在延伸階段遇到 TaqMan 探針時(shí)，它會(huì)置換并切割 5' 報(bào)告染料。 一旦報(bào)告染料與淬滅染料分離，其在每個(gè) qPCR 循環(huán)結(jié)束時(shí)的可測(cè)量熒光信號(hào)就會(huì)顯著增加。 第二條 DNA 鏈?zhǔn)瞧叫泻铣傻?，但由于沒有探針附著在它上面，因此無(wú)法通過熒光測(cè)量來(lái)監(jiān)測(cè)這一過程。

與 SYBR Green 檢測(cè)相比，使用 TaqMan 探針的成本更高，但也具有兩個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)：

• TaqMan 檢測(cè)僅測(cè)量目標(biāo)序列的擴(kuò)增進(jìn)程，因?yàn)樘结樖悄繕?biāo)特異性的。

• 您可以通過向主混合物中添加不同的引物和具有不同報(bào)告染料的 TaqMan 探針來(lái)監(jiān)測(cè)單個(gè)反應(yīng)中各種 qPCR 產(chǎn)物的數(shù)量。 這種多重方法允許您在每個(gè)熱循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光信號(hào)。

圖1.SYBR Green 與?TaqMan原理示意圖

對(duì)于這兩種 qPCR 方法，數(shù)據(jù)在擴(kuò)增圖中可視化，x 軸為熱循環(huán)數(shù)，y 軸為檢測(cè)到的熒光信號(hào)：

圖2.?qPCR 擴(kuò)增數(shù)據(jù)圖