引言

通常，難以從天然來(lái)源直接獲得高質(zhì)量的特定蛋白，尤其是人體蛋白。很多研究者通過(guò)將基因克隆至可在易培養(yǎng)細(xì)胞中操作的人工載體上，通過(guò)異源表達(dá)來(lái)克服這個(gè)問(wèn)題，這些細(xì)胞包括大腸桿菌、畢赤（酵母）及一系列的昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

是應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，市面上的重組蛋白有30%是由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)而來(lái)，是小分子細(xì)胞質(zhì)蛋白或結(jié)構(gòu)域表達(dá)的首選宿主。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的外源基因包括原核基因和真核基因；原核基因可以直接在大腸桿菌中表達(dá)出來(lái)，真核基因含有內(nèi)含子，大腸桿菌不能對(duì)mRNA進(jìn)行剪切形成成熟的mRNA，因此，真核基因一般以cDNA構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)。

優(yōu)勢(shì)：

表達(dá)背景清楚、表達(dá)水平高、宿主菌繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜、標(biāo)簽多樣、蛋白表達(dá)量大。

劣勢(shì)：

沒(méi)有真核生物的翻譯后修飾、大蛋白可能不能正常折疊、一些蛋白可能對(duì)宿主有毒性、包涵體復(fù)性難。

• 質(zhì)粒：Pet系列、pGEx系列、MBP（麥芽糖系統(tǒng)）
  

• 菌株：BL21、Rosetta等

• 標(biāo)簽：His、GST、MBP、SUMO、FLAG、GFP、HA等

主要應(yīng)用：制備抗原、蛋白酶活性檢測(cè)、蛋白互作（Co-IP、Pull-down等）、蛋白晶體研究、生化實(shí)驗(yàn)等。

酵母系統(tǒng)

自1979年，為了克服大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，延伸了酵母表達(dá)系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。與其他表達(dá)系統(tǒng)的基因存在于游離質(zhì)粒上不同，它的表達(dá)質(zhì)粒是通過(guò)同源重組整合在基因組上的，轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單（不需要病毒原液），表達(dá)菌株可以長(zhǎng)時(shí)間保持（大于10年）而不失活。

優(yōu)勢(shì)：

使用簡(jiǎn)單、表達(dá)量高、可大規(guī)模生產(chǎn)、相對(duì)低廉的價(jià)格、有很多真核的翻譯后修飾和加工、大蛋白能較好地折疊。

劣勢(shì)：

培養(yǎng)時(shí)間相較于細(xì)菌較長(zhǎng)、標(biāo)簽較少、不能進(jìn)行復(fù)雜的翻譯后修飾。

• 質(zhì)粒：pPIC3K、pPICZA、pPIC3.5K

• 菌株：X33、GS115

• 標(biāo)簽：6His、Myc

主要應(yīng)用：適合于穩(wěn)定表達(dá)有功能的外源蛋白質(zhì)，而且可大規(guī)模發(fā)酵，是理想的重組真核蛋白生產(chǎn)制備工具。

昆蟲(chóng)系統(tǒng)

屬于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，但不同于酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)轉(zhuǎn)座作用將轉(zhuǎn)移載體中的表達(dá)組件定點(diǎn)轉(zhuǎn)座到能在大腸桿菌中繁殖的桿狀病毒穿梭載體上，通過(guò)抗性和藍(lán)白斑篩選到重組穿梭質(zhì)粒，提取穿梭質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞后，得到的子代病毒即為重組病毒。將病毒上清浸染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得表達(dá)的重組蛋白。

優(yōu)勢(shì)：

大蛋白正確折疊、具有真核翻譯后修飾、毒性蛋白可被表達(dá)。

劣勢(shì)：

費(fèi)用較高、重組桿狀病毒費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)、需組織培養(yǎng)條件。

• 載體：pFastBAC
  

• 菌株：sf9、sf21、High-5等

主要應(yīng)用：用于生產(chǎn)具有哺乳動(dòng)物細(xì)胞末端唾液酸化修飾的N糖蛋白。

哺乳系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是表達(dá)治療性抗體的最佳系統(tǒng)，產(chǎn)生的抗體免疫原性最弱。哺乳動(dòng)物細(xì)胞擁有復(fù)雜的蛋白折疊和表達(dá)后修飾機(jī)制,其表達(dá)的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近高等生物天然蛋白質(zhì)的性狀。主要采用Hek293細(xì)胞和CHO細(xì)胞，可靈活滿足多種需求。

優(yōu)勢(shì)：重組DNA易轉(zhuǎn)染，遺傳穩(wěn)定，可重復(fù)；識(shí)別并去除了內(nèi)含子；具備翻譯后修飾（磷酸化、糖基化、二硫鍵、寡聚體等的形成、高級(jí)結(jié)構(gòu)的正確折疊）；產(chǎn)品的構(gòu)型正確率高，可被改造成類人體源性，免疫源性好；可分泌至培養(yǎng)基，提純工藝簡(jiǎn)單，成本低；可用于基因治療。

劣勢(shì)：培養(yǎng)基成本極高，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，至少一個(gè)月以上，培養(yǎng)較困難，表達(dá)量較低、構(gòu)成復(fù)雜、操作技術(shù)要求高、且有時(shí)會(huì)導(dǎo)致病毒感染。

• 載體：pcDNA3.1、pIRES、pTT3、pCEP4、pATX1

• 標(biāo)簽：Fc、His和Flag標(biāo)簽等
  

主要應(yīng)用：哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可進(jìn)行翻譯后修飾，表達(dá)的重組蛋白接近人源構(gòu)象，因此被大量用于治療性重組蛋白的生產(chǎn)。

表達(dá)系統(tǒng)的選擇

選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮蛋白質(zhì)的大小、需要蛋白質(zhì)的量、蛋白質(zhì)來(lái)源的物種，以及蛋白質(zhì)是否有二硫鍵和翻譯后修飾。如果只需要少量目標(biāo)蛋白——如當(dāng)篩選一系列點(diǎn)突變用于酶活性研究時(shí)，不需要優(yōu)化生產(chǎn)條件。但是，如果必須純化一個(gè)活性蛋白和/或需要大量蛋白質(zhì)時(shí)，在發(fā)現(xiàn)一個(gè)大規(guī)?？捎梅椒ㄇ熬托枰獓L試不同的宿主-載體系統(tǒng)、表達(dá)條件和/或純化方案。

展望

隨著藥物審批上市相關(guān)激勵(lì)政策不斷完善和落實(shí)，加上數(shù)字化技術(shù)在中國(guó)的迅速發(fā)展，中國(guó)生物醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)逐漸與世界接軌，國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)一致看好中國(guó)生物醫(yī)藥市場(chǎng)，紛紛開(kāi)始擴(kuò)大生物醫(yī)藥市場(chǎng)的部署與投資。重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)將會(huì)隨著生物技術(shù)的發(fā)展越來(lái)越成熟和多元化。

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