? ? ? ? 今天介紹的病毒是大腸桿菌P1噬菌體(Bacteriophage P1，P1 Virus)。這種溫和噬菌體可是Cre-LoxP的擁有者，而Cre-LoxP正是基因工程的重要工具。

簡介

? ? ? ?大腸桿菌P1噬菌體是一種溫和的噬菌體，可以感染大腸桿菌和其他一些細(xì)菌。當(dāng)進行溶原性循環(huán)時，噬菌體基因組不像其他溫和噬菌體(如λ噬菌體)那樣整合到宿主DNA中，以質(zhì)粒的形式存在于細(xì)菌中。大腸桿菌P1噬菌體引起了人們的研究興趣，因為它可以被用來將DNA從一個細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)菌細(xì)胞，這個過程被稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)它在裂解周期中復(fù)制時，它捕獲宿主染色體的片段。如果產(chǎn)生的病毒顆粒被用來感染另一個宿主，捕獲的DNA片段就可以整合到新宿主的基因組中。這種體內(nèi)基因工程的方法被廣泛使用了多年，直到今天仍然在使用，雖然程度較低。大腸桿菌P1噬菌體也可以用來制作噬菌體人工染色體(Phage Artificial Chromosome)克隆載體，該載體可以攜帶相對較大的DNA片段。大腸桿菌P1噬菌體編碼一種位點特異性重組酶Cre，該酶被廣泛用于在LoxP位點的靶DNA側(cè)翼進行細(xì)胞特異性或時間特異性的DNA重組。

病毒學(xué)特征

? ? ? ?大腸桿菌P1噬菌體有一個二十面體的頭部，其中的DNA附著在有六根尾纖維的可收縮尾巴上。尾巴有一個被收縮鞘包圍的管狀結(jié)構(gòu)。它的末端是一個帶有六根尾部纖維的底板。尾纖維參與附著在宿主上并提供特異性。

病毒基因組

? ? ? ?大腸桿菌P1噬菌體的基因組比較大，長度約為93Kbp。在病毒粒子中，它以線性雙鏈DNA分子的形式存在。一旦插入宿主體內(nèi)，它就會以質(zhì)粒的形式循環(huán)和復(fù)制。

? ? ? ?在病毒粒子中，DNA分子比基因組的實際長度長(110Kbp)。它是通過從具有多個基因組拷貝的串聯(lián)DNA鏈中切割一個適當(dāng)大小的片段來創(chuàng)建的(參見下面關(guān)于裂解的部分，了解這是如何制造的)。因此，DNA分子的兩端是相同的。這就是所謂的終端冗余。這對于DNA在宿主體內(nèi)的環(huán)狀化很重要。DNA從串聯(lián)體中切割出來的另一個后果是，一個給定的線性分子可以從環(huán)狀基因組的任何位置開始。這叫做循環(huán)排列。

? ? ? ?該基因組尤其富含細(xì)菌重組酶RecBCD識別的Chi序列。基因組包含兩個復(fù)制起點：OriR在溶原周期中復(fù)制，OriL在裂解階段復(fù)制。P1基因組編碼三個在裂解階段表達的tRNA。

? ? ? ?P1的基因組編碼112個蛋白質(zhì)和5個未翻譯的基因，開放閱讀框(ORF)數(shù)目大約是噬菌體λ的兩倍。

溶源性感染

? ? ? ?溫和噬菌體都可以造成溶源性感染。對于大腸桿菌P1噬菌體來說，其基因組在細(xì)菌中是一個低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。質(zhì)粒相對較大的尺寸要求它保持較低的拷貝數(shù)，以免作為溶菌原時成為太大的代謝負(fù)擔(dān)。由于每個細(xì)菌基因組通常只有一個質(zhì)粒副本，質(zhì)粒很有可能不會同時傳遞給兩個子細(xì)胞。P1質(zhì)粒通過幾種方法對抗這種情況：

? ? ? ? 質(zhì)粒的復(fù)制受到RepA蛋白依賴機制的嚴(yán)格調(diào)控。這與其他幾種質(zhì)粒使用的機制類似。它確保質(zhì)粒與宿主基因組同步分裂。

?? ? ? 互鎖質(zhì)粒可通過Cre-LoxP重組快速解連

? ? ? ?P1質(zhì)粒編碼一套系統(tǒng)，可以殺死失去質(zhì)粒的子細(xì)胞。它由一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)毒素和一種抗毒素組成，這種抗毒素可以可逆地結(jié)合并中和它。失去質(zhì)粒的細(xì)胞會被殺死，因為抗毒素比毒素降解得更快。

Cre-LoxP系統(tǒng)

? ? ? ?Cre-LoxP重組是一種位點特異性重組酶技術(shù)，用于對細(xì)胞DNA的特定位點進行缺失、插入、易位和倒置。它允許DNA修飾針對特定的細(xì)胞類型或由特定的外部刺激觸發(fā)。它是實現(xiàn)在真核和原核系統(tǒng)。Cre-LoxP重組系統(tǒng)在幫助神經(jīng)科學(xué)家研究大腦中復(fù)雜的細(xì)胞類型和神經(jīng)回路一起產(chǎn)生認(rèn)知和行為方面特別有用。NIH神經(jīng)科學(xué)研究藍圖已經(jīng)創(chuàng)建了數(shù)百個Cre驅(qū)動小鼠系，目前被世界范圍內(nèi)的神經(jīng)科學(xué)社區(qū)使用。

? ? ? ?該系統(tǒng)由一個單一的酶：Cre重組酶與重組一對短的目標(biāo)序列稱為LoxP序列。該系統(tǒng)無需插入任何額外的支持蛋白或序列即可實現(xiàn)。Cre酶和LoxP序列來自大腸桿菌噬菌體P1。

? ? ? ?適當(dāng)放置LoxP序列可以使基因被激活、抑制或交換其他基因。在DNA水平上可以進行多種操作。Cre酶的活性可以被控制，因此它可以在特定的細(xì)胞類型中表達，或者由化學(xué)信號或熱休克等外部刺激觸發(fā)。這些靶向的DNA變化在細(xì)胞譜系追蹤中是有用的，當(dāng)突變體在全球表達時是致命的。