液氮裂解細(xì)胞

小分子結(jié)合→不同梯度加熱→離心取上清液→跑Western電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→孵抗體→顯隱

DNA膠制作→跑電泳→回收DNA→測(cè)濃度→同源重組

提質(zhì)粒→測(cè)濃度

液氮反復(fù)凍融細(xì)胞裂解液（細(xì)胞+PBS）是最溫和的裂解細(xì)胞的方式，可以用于研究蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，小分子結(jié)合等。

具體操作：1 min凍+37℃水浴融化40% 反復(fù)

這里師姐是要看小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)的影響，用溫度來(lái)體現(xiàn)。要設(shè)置對(duì)比組（不加小分子的）

目的：將已經(jīng)克隆在一個(gè)載體上的基因克隆在另一個(gè)載體上。

實(shí)驗(yàn)思路：①設(shè)計(jì)一對(duì)引物（目的基因兩端+新載體同源臂），以原載體為模板，利用該引物將目的基因從原載體上p出來(lái)，這時(shí)目的基因上兩端攜帶了新載體的同源臂序列。②用引物將目的基因p出。（師姐前面已經(jīng)做完了）③DNA電泳回收目的基因。④同源重組

加熱3 min

1%（1 g / 100 mL）的DNA膠配50 mL：

1.稱0.5 g AGAROSE G-10膠于錐形瓶；

2.加入50 mL的1×TAE buffer（用50×稀釋好的）；

3.將錐形瓶放入微波爐，最高溫度，沸騰后每30s拿出來(lái)晃一晃，反復(fù)3-4次，使溶解充分均勻；

4.錐形瓶放入60℃水冷卻；⑥加入5 μL核酸紅色染料(10000× Ultra GelRed)，搖勻；

5.取模具，倒入模具，放置10 min

1.常溫放兩分鐘，拿手指上震蕩，甩一下，放冰上

2.全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管（這里要很多管），4℃離心 最高轉(zhuǎn)速15 min

1.挑一個(gè)點(diǎn)搖一夜

2.離心， 4000 J 6 min

3.取質(zhì)粒試劑盒（質(zhì)粒試劑盒有大中小三個(gè)規(guī)格，10 mL以內(nèi)mini，20 mL midi，100 mL max）

1.溫柔取下梳子，在裝了TAEbuffer的電泳槽中溫柔剝下膠，用刀片切下不用的，存儲(chǔ)在裝有TAE的塑料袋中，4℃

2.取1 kb Ladder；10× DNA Loading buffer

3.在DNA(25 μL)中加入2 μL的10× DNA Loading buffer

4.上Ladder

5.蓋蓋子，連電線，設(shè)置30 min（電壓沒記下）

這里DNA帶負(fù)電，往正極(紅色)跑

按照提質(zhì)粒試劑盒操作（P1混勻→P2溫和混勻放置3-5 min變清亮粘稠→E3顛倒出絮狀放3-5min離心取上清→上清過(guò)濾柱離心取濾液→加異丙醇→柱平衡→柱子中放入加異丙醇的混合液→離心棄濾液→吸附柱加buffer PW→離心棄廢液→再離心）

跑電泳：取上清液加PAGE loading buffer→shake→95℃金屬熱變性10 min

開紫外→關(guān)上→切下條帶放入離心管→根據(jù)Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit 試劑盒說(shuō)明提純

1.一個(gè)電泳槽跑兩張膠，短槽朝里（放膠沒有拍到）

2.配1 L電泳液:1L 1×Running buffer（10×Running buffer配方：432g Glycine+90.0gTris 加水3L）＋另加 10mL 10% SDS（10g/100mL 十二烷基磺酸鈉）

3.加電泳液入電泳槽（內(nèi)槽填滿，外槽有一些就行），拔梳子

4.金屬加熱后的蛋白放室溫冷卻，震蕩一下

5.上樣

6.電壓先低后高120V

儀器：Nano drop spectra photometer（蛋白和核酸濃度均可測(cè)）

1.用水洗三次

2.用水blank，做空白對(duì)照

3.加2 μL 質(zhì)粒 測(cè)出濃度為471 ng/μL（某個(gè)比值＞2認(rèn)為有RNA污染，＜1.8認(rèn)為有蛋白污染，1.8-2為核酸）

4.加2 μL DNA 測(cè)出濃度為44 ng/μL

5.水洗兩次

菌：載體PET28A

細(xì)胞：載體PRT5

轉(zhuǎn)膜重要！看姐手法 很多細(xì)節(jié)

1.轉(zhuǎn)膜液提前預(yù)冷4℃（具體什么沒記下來(lái)）

2.轉(zhuǎn)膜液用甲醇激活，去掉上一層下一層藍(lán)色保護(hù)紙

3.轉(zhuǎn)膜夾，黑膠白膜：白底→海綿→濾紙→膜→趕氣泡→膠（分正反 右上角切角）→趕氣泡→濾紙→海綿

4.轉(zhuǎn)膜裝置：黑對(duì)黑 白對(duì)紅

5.轉(zhuǎn)膜液倒入裝置

6.冰塊放入轉(zhuǎn)膜液

7.蓋蓋子紅對(duì)紅 黑對(duì)黑

8.200mA 1h

9.之后把膜放到20 mL 5%牛奶中,搖床封閉1h（5g/100mL 用TBST溶），再之后加抗體4℃過(guò)夜孵育一夜，第二天來(lái)顯隱