寫在前面

????????今天推薦的是由上海復(fù)旦大學(xué)第五人民醫(yī)院泌尿外科在2021年2月5日發(fā)表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（2020IF：11.161，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是施國(guó)偉教授，研究表明USP16通過去泛素化和穩(wěn)定c-Myc來調(diào)節(jié)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞增殖。

研究背景

????????c-Myc是一種成熟的致癌基因，在包括前列腺癌在內(nèi)的各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。然而，其在癌細(xì)胞中的機(jī)制在很大程度上仍然未知，是否存在靶向c-Myc的去泛素化酶也仍然難以捉摸。

摘要部分

????????作者使用生物信息學(xué)分析和shRNA篩選方法來鑒定與c-Myc基因特征相關(guān)的潛在去泛素化酶。通過CCK8和集落形成試驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞增殖和活力。另一方面，建立小鼠PC3細(xì)胞異種移植模型以確認(rèn)USP16在體內(nèi)的功能。USP16和c-Myc蛋白之間的相互作用通過免疫共沉淀和蛋白共定位分析進(jìn)行評(píng)估。作者還通過免疫組化染色檢測(cè)異種移植組織和臨床腫瘤組織中USP16、Ki67、c-Myc的表達(dá)。此外，通過RNA測(cè)序證實(shí)了USP16和c-Myc之間的相關(guān)性。

研究?jī)?nèi)容

1.USP16與c-Myc基因特征呈正相關(guān)? ? ?

????????為了探索可能調(diào)節(jié)c-Myc信號(hào)傳導(dǎo)的潛在DUB，作者對(duì)對(duì)照和c-Myc過表達(dá)PCa細(xì)胞(GSE51384)進(jìn)行了差異表達(dá)分析，揭示了310個(gè)c-Myc介導(dǎo)的上調(diào)基因，然后導(dǎo)入GSEA軟件進(jìn)行基因集富集分析。使用該數(shù)據(jù)集，作者在四個(gè)人類PCa數(shù)據(jù)集中篩選了與c-Myc特征正相關(guān)的泛素特異性蛋白酶(USP)。結(jié)果顯示五個(gè)USP在所有數(shù)據(jù)集分析中一致被識(shí)別。接下來，作者將五種USP的shRNA轉(zhuǎn)染到PC3細(xì)胞中，并通過qRT-PCR測(cè)量shRNA的敲低效率。通過蛋白質(zhì)印跡對(duì)c-Myc蛋白水平的分析顯示，USP16的敲低顯著降低了c-Myc的豐度?？傊@些數(shù)據(jù)表明USP16與c-Myc信號(hào)通路密切相關(guān)，可能在PCa中發(fā)揮重要作用。

研究結(jié)論：USP16與c-Myc基因特征高度相關(guān)。

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2.靶向USP16在體外抑制CRPC細(xì)胞增殖

????????為了更好地了解USP16在體外PCa細(xì)胞中的作用，作者在兩種CRPC細(xì)胞系中沉默了USP16：PC3和DU145細(xì)胞，其特征在于不依賴雄激素的生長(zhǎng)。通過蛋白質(zhì)印跡證實(shí)了USP16的敲低效率。然后使用CCK-8測(cè)定分析細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示USP16的敲低顯著降低了PCa細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)。集落形成分析產(chǎn)生了類似的結(jié)果，即USP16缺失導(dǎo)致細(xì)胞集落數(shù)相對(duì)于對(duì)照顯著減少。一致地，作者發(fā)現(xiàn)USP16的異位表達(dá)主要恢復(fù)了USP16敲低細(xì)胞的增殖率。

研究結(jié)論：USP16是CRPC細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的。

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3.USP16敲低抑制PCa腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)

????????為了進(jìn)一步闡明USP16在體內(nèi)PCa細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用，將穩(wěn)定表達(dá)shUSP16或?qū)φ誷hRNA的PC3細(xì)胞皮下注射到裸鼠中。8周后，處死小鼠并提取異種移植物用于進(jìn)一步研究。shCON比shUSP16組腫瘤更大且重量明顯更重。此外，USP16的抑制導(dǎo)致裸鼠的腫瘤發(fā)病延遲。異種移植組織的IHC染色分析顯示，抑制USP16降低了Ki67表達(dá)，表明USP16敲低會(huì)損害PCa細(xì)胞的增殖。

研究結(jié)論：抑制USP16顯著抑制了體內(nèi)PCa細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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4.USP16以去泛素化活性依賴的方式穩(wěn)定c-Myc

????????在之前的分析中，作者觀察到USP16在PCa細(xì)胞中的惡性作用，然后作者想進(jìn)一步揭示USP16發(fā)揮這種作用的潛在機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)USP16的敲低顯著降低了c-Myc蛋白豐度，但不影響其mRNA水平，表明USP16對(duì)c-Myc的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。此外，用蛋白酶體抑制劑MG132處理顯著減弱了USP16敲低對(duì)c-Myc蛋白水平的影響。接下來，作者使用放線菌酮(CHX)追蹤分析檢查了USP16是否可以調(diào)節(jié)c-Myc的穩(wěn)定性。作者發(fā)現(xiàn)USP16的異位表達(dá)增強(qiáng)了c-Myc蛋白的穩(wěn)定性，而USP16敲低降低了c-Myc蛋白的半衰期。

研究結(jié)論：USP16通過泛素化-蛋白酶體途徑特異性地維持c-Myc的穩(wěn)定性。

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5.USP16去泛素化c-Myc? ? ?

????????為了探索USP16和c-Myc之間的功能聯(lián)系，作者將帶有Flag標(biāo)簽和V5標(biāo)簽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，然后用抗Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀。發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)的USP16與c-Myc顯著相互作用，反之亦然。此外，當(dāng)Flag-c-Myc被Flag抗體免疫沉淀時(shí)檢測(cè)到USP16蛋白，當(dāng)Flag-USP16在PC3細(xì)胞中免疫沉淀時(shí)也檢測(cè)到c-Myc。內(nèi)源性c-Myc和USP16之間的相互作用也在PC3細(xì)胞中得到證實(shí)。接下來，作者使用免疫熒光染色證實(shí)了USP16和c-Myc在PC3和DU145細(xì)胞中的共定位。總之，這些數(shù)據(jù)表明USP16與c-Myc相互作用并共同定位。

????????為了確定USP16是否充當(dāng)c-Myc的DUB，HEK293T細(xì)胞用編碼HA-泛素和Flag-c-Myc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并用野生型USP16或其催化失活的突變體USP16-C205S轉(zhuǎn)染，并用MG132處理。野生型USP16，而非USP16-C205S，顯著降低了c-Myc的泛素化。此外，USP16的敲低顯著增強(qiáng)了c-Myc的多泛素化。接下來，作者探究了c-Myc蛋白的哪個(gè)多泛素修飾受USP16調(diào)節(jié)。HEK293T細(xì)胞用v5-USP16和Flag-c-Myc以及不同的HA-泛素（WT、K11、K48或K63）轉(zhuǎn)染。然后用抗Flag抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀。結(jié)果表明，USP16顯著降低了c-Myc的K48連接的泛素化。

研究結(jié)論：USP16與c-Myc共定位并相互作用，USP16使c-Myc去泛素化。

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6.USP16通過c-Myc調(diào)節(jié)PCa細(xì)胞生長(zhǎng)

????????c-Myc是一種參與細(xì)胞增殖的癌蛋白，已知c-Myc的過表達(dá)可增強(qiáng)多種癌細(xì)胞的活力。鑒于USP16調(diào)節(jié)c-Myc的穩(wěn)定性，作者檢查了USP16是否通過c-Myc調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。作者在USP16敲低的條件下破壞或過表達(dá)c-Myc。使用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)USP16和c-Myc的蛋白質(zhì)水平。集落形成分析結(jié)果表明c-Myc敲低可以消除USP16敲低在細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)方面的影響。此外，c-Myc過表達(dá)恢復(fù)了USP16沉默細(xì)胞的增殖和集落形成能力。這些發(fā)現(xiàn)通過CCK-8測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)。然后作者對(duì)有無USP16敲低的PC3細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq分析，并通過GSEA分析基因表達(dá)譜。與先前公布的數(shù)據(jù)集的篩選結(jié)果一致，Myc靶標(biāo)和Myc基因特征基因集在對(duì)照組中顯著豐富。總之，這些數(shù)據(jù)表明USP16主要通過穩(wěn)定c-Myc來調(diào)節(jié)PCa細(xì)胞增殖。

研究結(jié)論：USP16主要通過穩(wěn)定c-Myc來調(diào)節(jié)PCa細(xì)胞增殖。

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7.USP16表達(dá)在前列腺癌中升高

????????接下來，作者試圖在臨床樣本中確認(rèn)上述結(jié)果。作者通過IHC染色對(duì)PCa（n=70）和鄰近正常組織（n=70）中的USP16表達(dá)進(jìn)行了表征。正常前列腺組織的染色評(píng)分明顯弱于PCa組織。此外，作者注意到USP16染色評(píng)分與Gleason染色評(píng)分顯著相關(guān)，這表明USP16在PCa發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。為了進(jìn)一步評(píng)估PCa中USP16和c-Myc之間的關(guān)聯(lián)，作者使用包含82個(gè)人類PCa組織的組織微陣列檢測(cè)了USP16和c-Myc的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在USP16和c-Myc的染色評(píng)分之間存在正相關(guān)。

研究結(jié)論：USP16表達(dá)在前列腺癌中升高。

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結(jié)論與討論

????????USP16是一種新型的c-Myc去泛素化酶。USP16的下調(diào)顯著抑制了體外和體內(nèi)PCa細(xì)胞的生長(zhǎng)。USP16通過去泛素化和穩(wěn)定c-Myc來調(diào)節(jié)PCa細(xì)胞增殖，使其成為治療PCa的潛在候選藥物。

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Thank you!

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原文鏈接：

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-021-01843-8