易基因：RNA-BS揭示葉酸調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞m5C修飾和mRNA翻譯機(jī)制｜科研速遞
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葉酸作為一種必需B族維生素，是一種具有重要生物學(xué)功能（包括DNA甲基化調(diào)控）的甲基供體。正常的神經(jīng)發(fā)育和生理對細(xì)胞葉酸水平很敏感，而葉酸缺乏或過量都可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。最近已有研究表明葉酸與哺乳動物線粒體中tRNA m5C修飾和翻譯有關(guān)。然而，葉酸攝入對神經(jīng)元mRNA m5C修飾和翻譯的影響在很大程度上仍然未知。
2022年11月23日，美國弗吉尼亞理工大學(xué)謝荷煌教授團(tuán)隊以“Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells”為題在《BMC Biology》雜志上發(fā)表研究論文，該研究通過RNA-BS和對應(yīng)的RNA-seq測序分析揭示了葉酸對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)mRNA m5C甲基化和翻譯的作用，并闡明了mRNA m5C甲基化和mRNA翻譯之間的潛在聯(lián)系。
標(biāo)題：Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells（葉酸調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的RNA m5C修飾和翻譯）
時間：2022.11.23
期刊：BMC Biology
影響因子：IF 5.4
技術(shù)平臺：RNA-BS、RNA-seq、RT-qPCR、Western blot等
樣本：
從側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)分離小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSC），將NSC放置在聚鳥氨酸和層粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿中，并在第2天更換培養(yǎng)基將細(xì)胞培育4天。根據(jù)葉酸（FA）濃度將細(xì)胞分為三個處理組：低FA組（LF，1.5μmol/L）、中FA組（MF，10μmol/L）和高FA組（HF，80μmol/L），兩個生物學(xué)重復(fù)，共6個mRNA-seq文庫和6個mRNA BS-seq文庫。
研究摘要：
本研究在三種不同濃度的葉酸中培養(yǎng)的NSC顯示出不同的mRNA甲基化譜。盡管只發(fā)現(xiàn)了少數(shù)差異表達(dá)基因，但在葉酸缺乏或補(bǔ)充的神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）中發(fā)現(xiàn)數(shù)百個差異翻譯基因。低濃度葉酸誘導(dǎo)的差異翻譯基因與細(xì)胞質(zhì)翻譯和線粒體功能相關(guān)，而高濃度葉酸誘導(dǎo)的差異翻譯基因與神經(jīng)干細(xì)胞增殖增加相關(guān)。與總mRNA相比，多聚體mRNA中m5C水平高。此外，綜合分析表明RNA m5C甲基化與mRNA翻譯效率之間存在轉(zhuǎn)錄特異性關(guān)系。
研究結(jié)果
（1）不同葉酸濃度對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中mRNA豐度的影響
（2）小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的整體m5C?mRNA圖譜
圖2：mRNA BS-seq數(shù)據(jù)集中高置信度m5C位點表征。
兩個重復(fù)之間m5C位點重疊維恩圖。
兩個重復(fù)之間重疊m5C位點的甲基化水平相關(guān)性點圖。
兩個重復(fù)中重疊和非重疊m5C位點甲基化水平箱線圖。
圖3：m5C修飾在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞總mRNA中的分布。
a-b. NSC中m5C位點(a)和m5C修飾(b)的mRNA占總mRNA的數(shù)量條形圖。
c. NSC中總mRNA中m5C位點的甲基化水平箱線圖。
NSC中總mRNA中m5C位點附近序列標(biāo)記。
m5C位點沿mRNA轉(zhuǎn)錄本(5'UTR、CDS、3'UTR)分布密度圖。顯示mRNA m5C位點百分比的移動平均值。
三種不同濃度葉酸條件下(LF、MF、HF) m5C位點重疊維恩圖。
m5C修飾的mRNA在LF、MF和HF中的GO分析氣泡圖
（3）葉酸以劑量依賴性方式誘導(dǎo)mRNA翻譯變化
圖4：葉酸缺乏和補(bǔ)充影響NSC的mRNA翻譯。
a-b. 分離無核糖體和結(jié)合核糖體RNA的蔗糖梯度示意圖(a)和254nm下記錄的代表性polysome圖譜(1.5μM FA，replicate 1)的部分polysome (9-15部分)(b)。
c. LF和MF之間的差異翻譯基因(DTGs)的比較火山圖。
d. HF和MF之間差異翻譯基因(DTGs)的比較火山圖。
e. DTGs的GO分析氣泡圖，LF的翻譯效率降低(LF vs MF下調(diào))，HF的翻譯效率降低(HF vs MF下調(diào))，HF的翻譯效率增加(HF vs MF上調(diào))
（4）葉酸誘導(dǎo)polysome mRNA?m5C甲基化水平變化
圖5：葉酸對小鼠NSC?polysome mRNA?m5C甲基化的影響。
Polysome?mRNA中m5C位點附近序列的序列頻率標(biāo)志。
m5C位點沿mRNA轉(zhuǎn)錄本（5′UTR、CDS、3′UTR）分布密度圖。顯示百分比的移動平均值。
Polysome?mRNA中m5C位點甲基化水平方框圖。
pMF和pLF之間差異甲基化m5C位點的甲基化水平比較熱圖。兩個生物學(xué)重復(fù)（R1、R2）。
pMF和pHF之間差異甲基化m5C位點的甲基化水平的比較熱圖。兩個生物學(xué)重復(fù)（R1、R2）。
pMF vs pLF和pMF vs pHF mRNA DMS修飾的GO注釋。
（5）m5C修飾與mRNA翻譯相關(guān)性
圖6：m5C甲基化與mRNA翻譯相關(guān)性。
a–c. 總mRNA和Polysome?mRNA之間的差異甲基化的m5C位點甲基化譜熱圖。
d–f. 總mRNA和Polysome?mRNA之間的差異表達(dá)基因（DEG）Volcano圖。
g–i. m5C甲基化水平顯著變化的mRNA分布，分三類：m5C甲基化與mRNA翻譯效率之間的正相關(guān)、負(fù)相關(guān)和中性相關(guān)。
j. 不同m5C甲基化mRNA翻譯相關(guān)類別位點分布的堆積條形圖。
k. 三種不同葉酸濃度條件下m5C甲基化和mRNA翻譯之間具有一致正/負(fù)/中性相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄本匯總表。
研究結(jié)論
本研究通過RNA-BS和RNA-seq聯(lián)合分析表明了葉酸對NSC轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)mRNA m5C甲基化和翻譯的作用，并揭示了mRNA m5C甲基化和mRNA翻譯之間的潛在聯(lián)系。m5C甲基化調(diào)控mRNA翻譯的機(jī)制值得使用體內(nèi)模型進(jìn)行進(jìn)一步研究。
關(guān)于易基因RNA m5C甲基化測序(RNA-BS)技術(shù)
m5C是RNA百余種修飾中研究較多的一種。m5C存在于tRNA上時，可以對翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)；存在于rRNA上時，可以對核糖體的生物合成進(jìn)行質(zhì)控；存在于mRNA上時，則可以影響mRNA的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及翻譯過程。
易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測序技術(shù)：
常規(guī)mRNA m5C甲基化測序（RNA-BS）：
mRNA分離后首先通過亞硫酸鹽處理，非甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁，m5C修飾的堿基保持不變，結(jié)合高通量測序，可以對RNA上的每一個C堿基修飾進(jìn)行定位與定量。常規(guī)mRNA +lncRNA m5C甲基化測序（全轉(zhuǎn)錄組RNA-BS）：
易基因科技建立的升級版m5C RNA甲基化測序服務(wù)，去除人rRNA后，剩余RNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，結(jié)合高通量NGS策略，可在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)單堿基分辨率地檢測基因m5C甲基化修飾分布。
技術(shù)優(yōu)勢：
高深度：超高深度重亞硫酸鹽處理，檢測準(zhǔn)確性極高；
高通量：結(jié)合高通量NGS，全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測；
單堿基：單堿基分辨率，快速檢測和分析RNA中的m5C。
高準(zhǔn)確：精確的檢測mRNA等每一個C堿基的的修飾水平。
研究方向：
與m6A甲基化類似，m5C甲基化已被證明與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、代謝性疾病、病毒感染以及個體發(fā)育等密切相關(guān)。
此外，RNA甲基化（m5C）與人類疾病密切相關(guān)，其功能涉及調(diào)控干細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞毒性應(yīng)激、mRNA出核和植物細(xì)胞發(fā)育及基因表達(dá)等方面。
實驗策略：
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整體解決方案，詳詢易基因：0755-28317900。
參考文獻(xiàn)：
Xu X, Johnson Z, Wang A, Padget RL, Smyth JW, Xie H. Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells. BMC Biol. 2022 Nov 23;20(1):261.
