對于需要用細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)的人來說，污染絕對是能讓人“暴走”的問題。戰(zhàn)戰(zhàn)兢兢養(yǎng)了大半個(gè)月的細(xì)胞一夜之間全軍覆沒帶來的打擊，想必養(yǎng)細(xì)胞的人都不陌生。污染，簡直就是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的魔咒，讓一切陷入無盡的循環(huán)當(dāng)中……本期內(nèi)容小恒整理了細(xì)胞培養(yǎng)常見的生物污染類型、解決方案以及細(xì)胞房的操作規(guī)范，希望能給養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴們帶來幫助。

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1.?細(xì)菌污染

污染來源：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等。

常見菌種：白色葡萄球菌、大腸桿菌、假單孢菌、枯草桿菌等。

污染特征：顯微鏡下可觀察到大小不一（0.5～5μm）的物質(zhì)，比細(xì)胞小很多，低倍鏡下呈沙粒狀布滿細(xì)胞間隙或培養(yǎng)基，高倍鏡下多呈球狀或桿狀，形態(tài)規(guī)則，分布均勻，鏡下觀察有明顯的定向運(yùn)動；增殖速度快，一般污染后48~72h爆發(fā)式增殖；營養(yǎng)消耗快，培養(yǎng)基pH發(fā)生變化，顏色很快變黃，變渾濁，甚至可能有明顯的異味；細(xì)胞生長緩慢，形態(tài)發(fā)生改變甚至脫落死亡。

處理建議：輕度污染或細(xì)胞比較珍貴：可用10～20×雙抗清洗處理。吸出培養(yǎng)基，以PBS清洗2～3遍，加胰酶消化至細(xì)胞形態(tài)略有變化但未脫離容器底部，加PBS輕輕潤洗1次后加入20×高濃度雙抗浸泡細(xì)胞3～5min，棄雙抗；加入含10×雙抗的無污染完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)12h后正常傳代，并仍以含10×雙抗的完培進(jìn)行培養(yǎng)，若第二代鏡下未觀察到細(xì)菌，第三代則可用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代48h后無反彈認(rèn)為污染已清除。重度污染建議直接消殺丟棄后對培養(yǎng)箱進(jìn)行徹底消毒。為預(yù)防細(xì)菌感染，建議日常培養(yǎng)基中正常添加雙抗。

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2.?真菌污染

污染來源：一般是來自實(shí)驗(yàn)服，并且具有氣候性，多雨、氣候濕潤的季節(jié)容易出現(xiàn)。

常見菌種：曲霉菌、白色念珠菌、酵母菌、黑霉菌、孢子菌等。

污染特征：肉眼下可觀察到培養(yǎng)液中有淡黃色或是白色的點(diǎn)狀漂浮物，短期內(nèi)培養(yǎng)基一般不變混濁。倒置顯微鏡下可見細(xì)胞之間有絮狀交錯(cuò)的菌絲或菌團(tuán)，在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長。細(xì)胞被污染后仍可生長，長時(shí)間細(xì)胞的活力狀態(tài)會變差。

處理建議：在PBS潤洗、換液后可加入兩性霉素B（注意兩性霉素B有細(xì)胞毒性，使用后可能會有副作用），也可加入300μg/mL氟康唑培養(yǎng)，污染控制后改用150μg/mL培養(yǎng)2~3代。但真菌污染一般難以根除，若非必要，建議消殺后丟棄，對細(xì)胞房、培養(yǎng)箱、操作臺以及器皿和培養(yǎng)液等進(jìn)行全面消毒。

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3.?支原體污染

污染來源：血清、胰酶、已污染物的氣溶膠、操作人員的口腔及皮膚等。

常見種類：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支原體等。直徑約為 0.1～0.3 μm，具有變形能力，可通過過濾膜（0.22-0.45 μm）。

污染特征：細(xì)胞增殖減慢，鏡下觀察碎點(diǎn)變多、細(xì)胞邊界變得模糊、形態(tài)異常（拉絲、鋪展）、胞漿出現(xiàn)小顆?；蚩张荩瑺顟B(tài)越來越差；培養(yǎng)條件未變，培養(yǎng)基清澈；更換新的培養(yǎng)液，細(xì)胞狀態(tài)沒有恢復(fù)。支原體污染可通過氣溶膠傳播，影響同一細(xì)胞房其他細(xì)胞。

鑒定方法：分離培養(yǎng)法、PCR法、ELISA、DNA熒光染色法、電鏡等。

處理建議：支原體污染十分麻煩，若細(xì)胞已受支原體污染，最佳的處理方式是將細(xì)胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細(xì)胞株，培養(yǎng)箱的其他細(xì)胞可用支原體抑制培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2代，以作預(yù)防，并使用支原體環(huán)境消毒試劑進(jìn)行環(huán)境消毒。

對于珍稀細(xì)胞：

1）采用支原體抑制試劑處理細(xì)胞，根據(jù)相關(guān)指南使用，周期結(jié)束后可以進(jìn)行鑒定。

2）清洗純化法，由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生，所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使?jié)撛谥гw數(shù)量降低至極限，并結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到較好的效果，但極有可能無法根除；

3）支原體特異性血清：用5%的兔支原體免疫血清可抑制支原體生長，一般抗血清處理后11天即可轉(zhuǎn)為陰性。

4）巨噬細(xì)胞吞噬法：將巨噬細(xì)胞與被支原體污染細(xì)胞共培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，為檢查支原體是否已被消除干凈，可利用支持物培養(yǎng)法驗(yàn)證，取出支持物逐日染色、鏡檢觀察，至支原體被消除干凈為止。

5）使用支原體抗體培養(yǎng)基，每2~3天更換1次新鮮培養(yǎng)液，換液時(shí)用無菌PBS洗滌細(xì)胞1~2次，保持適當(dāng)細(xì)胞密度；處理15天后，用支原體檢測試劑盒檢測支原體是否完全清除；

6）為避免細(xì)胞再次受到支原體污染，應(yīng)每隔1月進(jìn)行支原體的常規(guī)檢測，以保證沒有新的支原體污染。

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4.?黑膠蟲污染

污染來源：“黑膠蟲”是一種常見的細(xì)胞污染物，暫無明確定義，可存在于動物細(xì)胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，隨細(xì)胞傳代而傳代，是一種異養(yǎng)物質(zhì)，主要來源為血清。

污染特征：主要表現(xiàn)為細(xì)胞狀態(tài)差，培養(yǎng)基不渾濁，但鏡下觀察細(xì)胞周圍和培養(yǎng)液中出現(xiàn)很多黑點(diǎn)和碎片多，做布朗運(yùn)動，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長黑點(diǎn)和碎片逐漸增多，更換培養(yǎng)液或洗滌不能將其去除；“黑膠蟲”與細(xì)胞競爭性生長，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

處理建議：對于黑膠蟲污染的細(xì)胞，最快速有效的處理方式是使用黑膠蟲清除劑，同時(shí)確保培養(yǎng)體系中的血清必須為無黑膠蟲污染的優(yōu)質(zhì)血清。非珍稀或污染嚴(yán)重細(xì)胞建議直接丟棄。

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5.?細(xì)胞交叉污染

污染來源：細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會出現(xiàn)細(xì)胞交叉污染。目前，已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。

鑒定方式：同種屬進(jìn)行STR鑒定，多等位基因數(shù)大于3個(gè)。（需考慮本身的遺傳背景，如EA.hy 926為融合細(xì)胞，本身就包含兩套遺傳信息）；不同種屬進(jìn)行PCR法，對種屬特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增，不同種屬產(chǎn)物大小不同。

處理建議：建議重新引種。

預(yù)防建議：盡量避免多細(xì)胞同時(shí)操作，如傳代等；器具和培養(yǎng)溶液避免交叉使用。

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細(xì)胞房規(guī)范操作流程

1）進(jìn)入細(xì)胞房前穿戴實(shí)驗(yàn)服、口罩、手套及鞋套等，用消毒酒精擦拭雙手；

2）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：提前0.5～1h打開超凈臺紫外燈進(jìn)行消毒，同時(shí)將足量所需試劑、耗材等放置于消毒窗口，打開紫外燈進(jìn)行消毒。

3）按照個(gè)人習(xí)慣擺放試劑、耗材及儀器，切勿置于生物安全柜進(jìn)出風(fēng)口；

4）操作要準(zhǔn)確、敏捷、有序，盡量減少試劑和細(xì)胞瓶的敞口時(shí)間；專管專用，避免交叉污染；

5）操作完成后，將試劑放回原位；丟棄廢物和廢液；用酒精擦拭臺面進(jìn)行消毒；打開超凈臺及細(xì)胞房紫外燈，至少照射15min進(jìn)行消毒。

6）定期清理建議

環(huán)境消毒：每周一次定期消毒滅菌

a.地面/墻面：84消毒液、新潔爾滅交叉使用；b.環(huán)境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸；c.儀器設(shè)備表面：75%酒精擦拭，培養(yǎng)箱、顯微鏡托盤等高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域需經(jīng)常清潔，培養(yǎng)箱水盤和復(fù)蘇用的水浴鍋需添加抑菌劑；d.耗材消毒：需重復(fù)使用的耗材確保按照規(guī)定清洗、高溫高壓滅菌，使用滅菌指示帶。滅菌后烘干的耗材立刻放進(jìn)超凈臺，一周內(nèi)使用完畢，未使用完的，需重新滅菌再使用；e.定期進(jìn)行沉降菌檢測。?

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