重鏈抗體為駝類和軟骨魚類中天然存在的僅由兩條重鏈組成的特殊抗體，包含一個重鏈可變區(qū)（VHH, Variable domain of heavy chain antibody）和兩個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，CH1區(qū)天然缺失。重鏈抗體通過重鏈上的一個可變區(qū)（VHH）結(jié)合抗原，該可變區(qū)可以單獨(dú)穩(wěn)定地在體外存在，被稱為駝類單域抗體(SdAb)或者納米抗體（Nanobody）。納米抗體晶體直徑為2.5nm，長約4nm，分子量僅為傳統(tǒng)完整抗體的1/10（約15kD）但依然具有完整的抗原識別能力。

納米抗體相對于傳統(tǒng)抗體的優(yōu)勢

與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體還具有人源化簡單、親和力高、穩(wěn)定性高、可微生物表達(dá)、免疫原性低、可溶性好、滲透力強(qiáng)、可識別隱藏表位等優(yōu)勢。納米抗體獨(dú)特的物理和化學(xué)穩(wěn)定性等為診斷和治療提供了新的研究工具。在抗體藥物研發(fā)、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究以及疾病診斷和治療方面越來越受關(guān)注。

全球獲批上市的納米抗體藥物

2018年歐盟批準(zhǔn)全球首款用于治療成年獲得性血栓性血小板減少性紫癜的納米抗體藥物—Caplacizumab，通過阻斷超大vWF多聚體與血小板的相互作用，從而防止凝血的發(fā)生。2021年康寧杰瑞制藥，思路迪醫(yī)藥和先聲藥業(yè)合作開發(fā)的PD-L1抗體恩維達(dá)在中國獲批上市，是中國第一個獲批上市的納米抗體藥物。目前，已有多款納米抗體藥物處于臨床試驗(yàn)階段（表1）。

由于納米抗體的這些特征，越來越多的研究機(jī)構(gòu)和藥物生產(chǎn)企業(yè)在不同的場景中關(guān)注、嘗試使用納米抗體。而納米抗體的開發(fā)不同于傳統(tǒng)單克隆抗體通過雜交瘤制備的方法，它一般通過免疫羊駝、構(gòu)建噬菌體文庫和通過噬菌體展示來篩選出候選納米抗體，再通過納米抗體表達(dá)和純化后進(jìn)行與抗原是否結(jié)合的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

下面，我們將詳細(xì)講述篩選制備納米抗體的流程以及其中的關(guān)鍵點(diǎn)和操作技巧，其中的每一個步驟均由深圳康體生命經(jīng)過多次優(yōu)化和總結(jié)，供有需要和想嘗試納米抗體篩選的機(jī)構(gòu)參考。

單域抗體制備

獲得單域抗體的普遍方法是羊駝經(jīng)過抗原免疫后通過體內(nèi)免疫系統(tǒng)的作用使得抗體成熟，分離羊駝外周血B淋巴細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，以cDNA為底物PCR擴(kuò)增獲取多樣化納米抗體基因片段，然后將多樣化納米抗體基因片段連接到噬菌粒上，構(gòu)建噬菌體庫。然后通過噬菌體展示和篩選技術(shù)從羊駝抗體庫中篩選得到適合的候選納米抗體并對其進(jìn)行驗(yàn)證。整個流程主要包括羊駝免疫、噬菌體文庫構(gòu)建、抗體篩選、表達(dá)純化及驗(yàn)證等階段。

羊駝免疫

每次在羊駝頸部淋巴結(jié)附近分左右兩側(cè)皮下注射，每側(cè)分2點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射約0.4mL乳化好的抗原。免疫后觀察半小時確認(rèn)羊駝狀態(tài)良好，無不適癥狀。每2周免疫一次，至少進(jìn)行4次免疫。每次抗原免疫前進(jìn)行采血用于免疫評價，每次取5 mL血液；血液當(dāng)天使用預(yù)冷25℃離心機(jī)，4000 rpm離心10分鐘，分離凍存上層血清，用于后續(xù)抗體效價檢測。在第4次免疫后間隔5-7天從羊駝頸部靜脈進(jìn)行采血50 mL。分離淋巴細(xì)胞，-80℃保存。

技巧：羊駝的選擇和選擇合適的抗原是免疫成功的關(guān)鍵。選擇健康強(qiáng)壯、精神狀態(tài)良好、體型適中的未免羊駝即空白羊駝。免疫抗原的純度以及其正確構(gòu)象對免疫羊駝后篩選到合適的抗體以及后續(xù)應(yīng)用至關(guān)重要，蛋白抗原純度一般至少不低于90%。

淋巴細(xì)胞的分離：及時的細(xì)胞分離可以有效阻止血液采集后的溶血以達(dá)到最好的分離效果。

免疫周期的選擇可影響免疫效果，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，1-2周免疫間隔可以使羊駝對大部分抗原有良好的免疫反應(yīng)。

一只未免適齡羊駝可以同時免疫1-3個抗原，每次免疫每種抗原劑量保持在0.5 mg左右，總體積在1.5 mL以下，免疫前將抗原和佐劑體積1:1乳化使其形成均勻混合物。

構(gòu)建噬菌體庫

RNA提取：將外周血淋巴細(xì)胞冰上溶解后加入氯仿震蕩混勻；室溫靜置5分鐘后離心15分鐘；轉(zhuǎn)移上清液加入等體積的異丙醇；顛倒混勻室溫靜置10分鐘后4℃ 12000g離心10分鐘；棄上清后用75%乙醇清洗沉淀，4℃ 7500g 離心5分鐘后棄去上清，沉淀室溫晾干后溶解于適量的無RNA酶的水中。

反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA：將RNA一分為二反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

抗體片段擴(kuò)增：從反轉(zhuǎn)錄的cDNA中擴(kuò)增特定的抗體片段，使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，對0.7 kb大小的條帶切膠使用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收。以上一步PCR擴(kuò)增并回收后的DNA片段作為模板再次擴(kuò)增特定的抗體片段，使用Taq DNA Polymerase Hot Start Version酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收。?

克隆至噬菌體質(zhì)粒：將上一步擴(kuò)增得到的多樣化抗體基因序列和噬菌體載體進(jìn)行酶切，各自純化并進(jìn)行鏈接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收，并使用超純水溶解。

轉(zhuǎn)化TG1：提前將無菌的電轉(zhuǎn)杯置于冰上預(yù)冷，待TG1感受態(tài)細(xì)胞50?μL融化后加入100 ng回收后的連接產(chǎn)物，將混合后的感受態(tài)細(xì)胞和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷好的電轉(zhuǎn)杯中，使用電轉(zhuǎn)儀預(yù)設(shè)的Bacteria轉(zhuǎn)化程序電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)后立即往電轉(zhuǎn)杯中加入1 mL SOC培養(yǎng)基，至少進(jìn)行20個電轉(zhuǎn)，將細(xì)胞37℃復(fù)蘇60分鐘后涂在含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)板上過夜生長。將上一步過夜生長后的培養(yǎng)板上的細(xì)胞用2xYT培養(yǎng)基和涂布棒沖洗刮下，加入20%的甘油測OD600nm值后保存在-80℃，即為菌庫。

擴(kuò)增和純化噬菌體文庫：將上一步刮下的菌體混勻后將數(shù)目約為10^9個細(xì)菌轉(zhuǎn)移到100 mL預(yù)先加入氨芐抗生素的2x YT培養(yǎng)液中，37℃ 220 rpm培養(yǎng)直至OD600nm達(dá)到0.5。按照輔助噬菌體：細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目為20:1的比例加入輔助噬菌體后繼續(xù)37℃培養(yǎng)30分鐘。加入終濃度為50?μg/mL的卡那霉素，30℃過夜搖床培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌4℃ 13000 rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管后加入1/4體積預(yù)冷的 5x PEG8000/NaCl，在冰上孵育30-60分鐘。4℃ 13000 rpm離心10分鐘去除上清后加入1 mL PBS緩沖液溶解沉淀。再次加入250?μL 5X PEG8000/NaCl 后冰上孵育10分鐘，4℃ 16000 xg離心15分鐘后去除上清并將沉淀溶解在1 mL PBS中得到噬菌體庫，長期-80℃保存，短期（1-2周）可于-20℃放置保存。

技巧：噬菌體文庫的庫容量和多樣性是衡量文庫質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，容量越大、多樣性越好的庫是成功篩選出納米抗體的有效保證；

影響文庫容量和多樣性的關(guān)鍵點(diǎn)包括：提取RNA過程中RNA的降解、反轉(zhuǎn)錄過程中的模板和引物、擴(kuò)增過程中引物的選擇和模板的用量以及PCR擴(kuò)增輪數(shù)、感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率、連接體系的大小等因素。

抗體篩選鑒定

包被免疫管：將50?μg 抗原加入到2 mL PBS中并加入到免疫管中，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)過夜孵育。

封閉：將適量擴(kuò)增和純化的噬菌體加入到1 mL 3% BSA中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2小時。同時往包被好的免疫管中加入2-3 mL 3% BSA，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2小時。

抗原和噬菌體孵育：將封閉后的免疫管用含有0.01%吐溫的PBS洗3次，每次5分鐘。將封閉后的噬菌體文庫加入到封閉后的免疫管中，添加PBS直至2-3 mL，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1小時。

清洗：將抗原和噬菌體孵育后的免疫管用含有0.1%吐溫的PBS洗20次，每次5分鐘。

洗脫：將免疫管內(nèi)液體棄掉，盡量去除殘余液體，加入1 mL 0.25 mg/mL Trypsin溶液，室溫旋轉(zhuǎn)洗脫30分鐘，加入10?μL 10%AEBSF終止洗脫，將免疫管中的溶液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，即為第一輪篩選噬菌體洗脫液。

噬菌體洗脫液效價檢測：取第一輪噬菌體洗脫液10?μL，在1.5 mL離心管中10倍梯度稀釋，共稀釋10個梯度，在每個稀釋離心管中加入90?μL OD600為0.5-0.55的TG1菌液，混勻后37℃孵育30分鐘，將各個梯度的菌液涂布到2×YT固體培養(yǎng)基（Amp）中，37℃倒置過夜培養(yǎng)，第二天統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)板上的單菌落個數(shù)并計(jì)算噬菌體洗脫液效價；

第一輪噬菌體洗脫液的擴(kuò)增：取500μl第一輪篩選后得到的噬菌體洗脫液至5 mL OD600為0.5-0.55的菌液中，37℃，250 rpm繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，將全部菌液均勻涂布到含有100?μg/mL Amp和2%葡萄糖的2%瓊脂糖的固體培養(yǎng)板中，37℃過夜培養(yǎng)。第二天將培養(yǎng)板的菌落刮下來收集至離心管中，即為擴(kuò)增后的細(xì)菌子文庫。按照噬菌體文庫擴(kuò)增和純化方法，再重復(fù)篩選過程2次，逐次減半包被免疫管的抗原量，得到3次篩選后的洗脫噬菌體。洗脫的噬菌體可進(jìn)行NGS測序，得到與抗原結(jié)合的候選納米抗體DNA序列庫。

ELISA鑒定：

將最后一輪篩選得到的噬菌體梯度稀釋后，各取10?μL加入到OD600nm為0.5的TG1菌液中，37℃培養(yǎng)30分鐘后涂布含有氨芐霉素的2x YT培養(yǎng)板上，37℃過夜培養(yǎng)第二天得到單克隆菌落；隨機(jī)挑選至少192個單菌落進(jìn)行檢測，選取抗原包被孔與相應(yīng)對照孔吸光值比例大的菌落送去測序（獨(dú)立兩次phage-Elisa分析），得到候選納米抗體的基因序列。

技巧：合適量的抗原包被和抗原的分子量大小、疏水親水性質(zhì)、結(jié)構(gòu)有關(guān)，也和包被緩沖液和包被介質(zhì)的選擇有關(guān)，合理的包被是成功篩選的基礎(chǔ)，如果有必要可以進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定包被的條件或者可選擇抗原結(jié)合磁珠的方法進(jìn)行篩選。

洗脫后測定噬菌體的效價，經(jīng)過2-4輪抗原包被淘選后，噬菌體的富集程度需要在合理范圍之內(nèi)。

納米抗體表達(dá)純化推薦流程

Phage-Elisa篩選出的單克隆菌株進(jìn)行納米抗體片段DNA測序后即可進(jìn)行表達(dá)純化及驗(yàn)證。

納米抗體可在大腸桿菌，酵母或哺乳動物細(xì)胞系里進(jìn)行表達(dá)，因其僅含100多個氨基酸殘基，為驗(yàn)證其是否與抗原結(jié)合，可構(gòu)建質(zhì)粒在大腸桿菌中或酵母菌株中進(jìn)行快速表達(dá)及純化，或者同時在兩種菌株中進(jìn)行表達(dá)純化。

大腸桿菌中納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)及純化：

質(zhì)粒構(gòu)建序列確認(rèn)后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，如BL21，挑取單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，菌體破碎后將上清液中可溶蛋白進(jìn)行純化，包括親和層析，離子交換層析及分子篩層析等方法。

畢赤酵母中納米抗體的表達(dá)及純化：

質(zhì)粒構(gòu)建序列確認(rèn)后及酶切線性化后將線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)酵母如GS115或X33菌株中，平板上篩選確認(rèn)單菌落后甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，分泌至胞外，發(fā)酵液上清中的納米抗體可直接Elisa驗(yàn)證，陽性序列進(jìn)行純化。

大腸桿菌表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是可迅速誘導(dǎo)表達(dá)，缺點(diǎn)是部分納米抗體可形成包涵體，其胞內(nèi)還原環(huán)境不利于納米抗體中二硫鍵的形成，畢赤酵母表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是可利用畢赤酵母對蛋白進(jìn)行胞外分泌，從而不用進(jìn)行菌體破碎，而直接從酵母發(fā)酵上清液中進(jìn)行納米抗體純化，并且酵母很少分泌雜蛋白至胞外使得發(fā)酵上清液中的納米抗體純度相對較高從而易于純化，并且胞外的氧化環(huán)境有利于納米抗體二硫鍵的形成，納米抗體中二硫鍵的形成對納米抗體的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

候選納米抗體純化后可驗(yàn)證其與抗原是否結(jié)合及與抗原結(jié)合的親和力檢測:

SPR實(shí)驗(yàn)利用的機(jī)型為BiacoreT200，具體操作流程詳見《BiacoreT200檢測蛋白與蛋白結(jié)合操作指南》。

納米抗體的規(guī)模表達(dá)純化：

因納米抗體為分子量約15KD左右的單鏈蛋白，其可由大腸桿菌或酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并在發(fā)酵罐中規(guī)模表達(dá)，其產(chǎn)量均在g/L以上，故可進(jìn)行量產(chǎn)應(yīng)用于試劑盒檢測，甚至臨床藥物規(guī)模化量產(chǎn)。

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