免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型【北京動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外包】
免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型【北京動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外包】
免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型主要用于人類多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS）的研究。
MS是一種在西方國(guó)家發(fā)病率很高的自身免疫性疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(exper imental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的病理變化與發(fā)病機(jī)制與急性MS極其相似。因此，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)為目前國(guó)際公認(rèn)的MS動(dòng)物模型。成功的建立EAE模型對(duì)MS的研究有很重要的作用。
（一）自發(fā)性及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型
近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)小鼠更易通過(guò)雜交系或利用基因敲除技術(shù)制作具有特殊遺傳基因背景的品系，用于MS/EAE免疫訓(xùn)節(jié)機(jī)制障礙的研究。例如，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)受體基因缺陷小鼠較同系野生型小鼠 EAE模型脫髓鞘和軸索損傷程度輕，說(shuō)明TNF-a是介導(dǎo)脫髓鞘和軸索損傷的重要細(xì)胞因子；又如MHCI類基因缺陷的C57BL/6 基因敲除小鼠，用寡樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG）或含脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein,PLP）不能誘發(fā) EAE，這可能是由于其不具有同系野生型小鼠處理和提呈這些髓鞘抗原的能力。
（二）誘發(fā)性動(dòng)物模型
EAE模型按臨床病程通常分為4型：
1.急性單相(AM)型 常用髓鞘素抗原如髓鞘素堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、含脂質(zhì)蛋白(PLP)免疫 Lewis 大鼠，或用寡樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)35-55 多肽片段免疫B6小鼠，也可通過(guò)MBP或其多肽片段致敏的T淋巴細(xì)胞系被動(dòng)轉(zhuǎn)輸給正常大鼠誘發(fā)，病程短，以急性腦脊髓炎病變?yōu)橹?，脫髓鞘較輕，可完全恢復(fù)。
2.復(fù)發(fā)緩解(RR）型 一般為雙相病程（發(fā)病2次），可以自愈，用PLP免疫SJL小鼠是理想的RR型模型。
3.遷延復(fù)發(fā)(PR）型 也稱慢性復(fù)發(fā)(CR）型，病情較重，死亡率較前兩型高；RR與PR型不易誘發(fā)，常需一定品系動(dòng)物如Lewis大鼠的某些亞系、DA大鼠或某些特殊基因背景的小鼠，并用特定的免疫原如MOG35-55多肽片段，有時(shí)需增加其他誘導(dǎo)方法，如轉(zhuǎn)輸CD4+T細(xì)胞，注射抗髓鞘成分特異性抗體或致腦炎因子白細(xì)胞介素12等，此兩型EAE脫髓鞘及軸索損傷明顯，臨床表現(xiàn)與MS頗近似。
4.慢性進(jìn)展(CP）型
【造模機(jī)制】用豚鼠脊髓勻漿(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH）作為實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的抗原。等體積的GPSCH 和完全弗氏佐劑(complete freund's ad-juvant,CFA)混合后致敏動(dòng)物，即可造成Wistar大鼠 EAE模型。
【造模方法】
1.動(dòng)物選擇 根據(jù)動(dòng)物對(duì)EAE的敏感性，制備模型主要選用的動(dòng)物有C3H/HeJ,SJI/J,B10PL,PL/J小鼠，Hartley,Stisin13豚鼠及新西蘭白兔等。由于實(shí)驗(yàn)研究的需要，大鼠 EAE模型的應(yīng)用越來(lái)越多，目前報(bào)道較多的大鼠模型所用大鼠品系主要為對(duì) EAE敏感的 Lewis 大鼠。國(guó)內(nèi)目前誘發(fā)大鼠 EAE模型的常用免疫原為自提取的DA大鼠脊髓勻漿(DA-SCH)或異種腦、脊髓勻漿，所用動(dòng)物大多為 Lewis 大鼠、Wistar 大鼠或豚鼠。Wist-ar大鼠一直被認(rèn)為對(duì) EAE誘導(dǎo)具有抵抗性(EAE-resistant)。近年來(lái)，成功地誘導(dǎo)了 Wist-ar大鼠急性及復(fù)發(fā)性 EAE，推動(dòng)了多發(fā)性硬化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。國(guó)外越來(lái)越多的研究者應(yīng)用不同的MOG 肽段或 DA-SCH為免疫原誘發(fā)緩解-復(fù)發(fā)型模型，以更好模擬人類MS的發(fā)病過(guò)程。其中 MOG35-55及DA-SCH漿組為緩解-復(fù)發(fā)型，更接近于人類 MS的發(fā)病過(guò)程，具有更廣的應(yīng)用前景。儀器藥品：顯微鏡、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、百日咳疫苗（BPV）等。
2.模型制作 取豚鼠2只，麻醉后經(jīng)心灌注生理鹽水至沖出液為無(wú)色，迅速取出脊髓去除脊膜，稱重后放入組織研磨器，加入等量生理鹽水研磨成50%的豚鼠脊髓勻漿(GP-SCH）。將等體積的GPSCH和完全弗氏佐劑(CFA）混合，用注射器在冰上抽打，直至成為油包水乳劑，此即免疫抗原。以上過(guò)程均注意無(wú)菌操作?？乖灰吮４?，應(yīng)立即使用。30只Wistar大鼠隨機(jī)平均分為3組：一次免疫組（A組），二次免疫組(B組)和生理鹽水對(duì)照組（C組）。其中A,B兩組大鼠用免疫抗原，0.4ml/只，C組給生理鹽水+等量CFA,.0.4m1l/只。給藥方式均為背部皮下注射，分為4點(diǎn)，每點(diǎn) 0.1ml。最后每組動(dòng)物均在右足腳背皮內(nèi)注射 O.1ml百日咳疫苗(BPV）(約含2×100個(gè)菌體）。接種抗原后第15天，將等體積的GPSCH 和不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant,IFA)混合成油包水乳劑，用同樣方法給B組注射。
3.觀察指標(biāo) 每天觀察動(dòng)物的飲食、活動(dòng)情況及體重。EAE評(píng)分采用如下標(biāo)準(zhǔn)。0分：動(dòng)物無(wú)任何癥狀；1分：動(dòng)物尾部無(wú)力或步態(tài)輕度笨拙；2分：動(dòng)物尾部無(wú)力十后肢無(wú)力，人為將鼠翻倒后能夠復(fù)位；3分：肢體完全癱瘓，人為翻倒后不能復(fù)位；4分：瀕死狀態(tài)或死亡。A,B兩組動(dòng)物于各自發(fā)病高峰期，C組動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)后2周，全部處死，常規(guī)甲醛 PBS溶液經(jīng)心全身灌注固定，取出大腦，再浸泡固定1天，作冷凍切片(厚5μl)。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。
【模型特點(diǎn)】復(fù)制模型表現(xiàn)為，少食消瘦、委靡發(fā)燒、肢體癱瘓、尿便障礙、重則抽搐死亡。病理觀察可見(jiàn)，腦脊髓表靜脈充盈。腦和脊髓彌漫性水腫。腦脊髓膜充血，脊髓各段小血管周圍有大量單核、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，形成典型的“血管套”。血管內(nèi)膜增厚，管腔變小，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分有神經(jīng)膠質(zhì)增生，Weils髓鞘染色，腦內(nèi)髓鞘斷裂和崩解，嚴(yán)重的有廣泛的神經(jīng)髓鞘變性、脫失，但軸突相對(duì)完整，以腦干和脊髓等為著，其中大多局限在炎癥改變明顯的血管套周圍的白質(zhì)區(qū)。
【注意事項(xiàng)】
1.應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇易感動(dòng)物造模 并注意動(dòng)物的類型、品系、年齡、性別。
2.注意所用的抗原純度、類型、計(jì)量、物理形態(tài)和注射方法會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3.應(yīng)用同一批次的佐劑及其他試劑。
【應(yīng)用范圍】該模型是神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的一個(gè)十分有用的模型。主要用于研究人類多發(fā)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制及藥物治療效果等。
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