線性mRNA疫苗的應(yīng)用受其不穩(wěn)定性、低效率和先天免疫原性的限制，而結(jié)合內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRESs）和開放閱讀框（ORF）的circRNA疫苗提供了一種改進(jìn)的RNA疫苗接種方法，具有安全性、穩(wěn)定性、制造簡單性和可擴(kuò)展性等優(yōu)勢。

2023年9月11日，陸軍軍醫(yī)大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）連繼勤教授團(tuán)隊在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=39.3）發(fā)表了綜述文章“Circular RNA vaccine in disease prevention and treatment”。文章全面描述了circRNA疫苗，總結(jié)和討論了包括設(shè)計、合成和純化的制備方法學(xué)研究，強調(diào)了circRNA疫苗的遞送選擇及其在疾病治療和預(yù)防中的潛在應(yīng)用。

mRNA疫苗作為第一代RNA疫苗，在儲存和體內(nèi)遞送方面都非常不穩(wěn)定，解決這一局限性的策略會大大增加mRNA疫苗的生產(chǎn)成本。因此，需要尋找其他替代方法來充分釋放RNA疫苗的潛力，而體外合成circRNA的技術(shù)突破使下一代RNA疫苗成為可能。從2022年開始，使用人工circRNAs表達(dá)相關(guān)抗原以觸發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在2019年新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）和難以治療的黑色素瘤惡性腫瘤中顯示出治療和預(yù)防效果。

circRNA疫苗的研究歷史

circRNA疫苗的研制可分為三個階段。

第一階段

1976年，circRNA首次被發(fā)現(xiàn)，其形成機(jī)制得到闡明。

第二階段

1981～2022年，circRNA體外合成技術(shù)的發(fā)展；

1982年，酶連接法；1992年，PIE系統(tǒng)；1993年，化學(xué)連接；1994年，外源序列環(huán)化；1995年，引入IRES以工程化翻譯circRNA；1998年，通過PIE系統(tǒng)工程化翻譯circRNA；2011年，HPLC法純化circRNA；2016年，各種IRES候選物的鑒定；2018年，PIE系統(tǒng)的高效優(yōu)化；2019年，降低人工circRNA免疫原性；2022年，circRNA高效翻譯。

第三階段

2022年～至今，首次將工程化circRNA疫苗用于COVID-19和黑色素瘤的治療和預(yù)防中，未來將繼續(xù)推動相關(guān)研究和技術(shù)發(fā)展。

circRNA疫苗的制備

circRNA疫苗的制備主要包括circRNA的設(shè)計、合成、純化、circRNA包封、藥效學(xué)、安全性評價、制造和臨床試驗。

根據(jù)目標(biāo)抗原設(shè)計肽/蛋白的編碼序列，并將其克隆到質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)中。質(zhì)粒DNA通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）技術(shù)轉(zhuǎn)錄成線性RNA前體（pre-circRNA）。接著，pre-circRNA在體外被環(huán)化為circRNA。circRNA通過高效液相色譜（HPLC）進(jìn)一步純化以去除污染物和反應(yīng)物。之后，純化的circRNA被封裝在各種載體中。在臨床試驗之前，應(yīng)進(jìn)行藥效學(xué)和生物安全性評估。最后，通過臨床試驗進(jìn)行circRNA疫苗的規(guī)?；a(chǎn)。在引發(fā)抗原特異性免疫反應(yīng)方面，circRNA疫苗主要遵循細(xì)胞內(nèi)過程的三個方面，包括內(nèi)體逃逸、抗原編碼和免疫啟動。

簡而言之，在抗原呈遞細(xì)胞（APCs）中，

（1）含有circRNA疫苗的LNPs在細(xì)胞質(zhì)中形成內(nèi)體；

（2）內(nèi)體釋放circRNA疫苗（內(nèi)體逃逸）；

（3）circRNA中的編碼序列通過核糖體翻譯成抗原性蛋白/肽；

（4）內(nèi)源性抗原被蛋白酶體降解成多肽，并通過MHC I進(jìn)行呈遞；

（5）激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+ T細(xì)胞），除了細(xì)胞免疫外，circRNA誘導(dǎo)的體液免疫對疾病預(yù)防也很重要；

（6）APCs中的內(nèi)源性抗原可被分泌并由MHC II類蛋白呈遞給輔助性T細(xì)胞，輔助性T細(xì)胞（CD4+ T細(xì)胞）刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體。

circRNA疫苗的潛在應(yīng)用

circRNA疫苗在COVID-19和黑色素瘤的治療和預(yù)防中取得了令人鼓舞的結(jié)果。但circRNA疫苗的應(yīng)用研究還處于早期階段。作為下一代RNA技術(shù)，工程化circRNA與mRNA疫苗共享相同的ORF依賴性抗原表達(dá)技術(shù)。由于更高的穩(wěn)定性、更低的免疫原性和更出色的抗原編碼能力，circRNA可以重新設(shè)計并取代mRNA疫苗骨架以獲得更好的治療或預(yù)防效果。因此，circRNA疫苗在其他病毒感染、其他腫瘤、自身免疫性疾病、代謝性疾病、心血管疾病和囊性纖維化等疾病中具有有前途的應(yīng)用前景。

總結(jié)與展望

根據(jù)目前的研究結(jié)果，有一些建議可以作為未來研究的方向：

1、核苷酸修飾可能協(xié)同增強circRNA疫苗的穩(wěn)定性并降低免疫原性；

2、環(huán)化方法有待進(jìn)一步研究；

3、迫切需要新的純化方法來獲得高純度的circRNA。

總之，迫切需要開發(fā)和改進(jìn)體外人工circRNA疫苗的設(shè)計、合成、純化、遞送和治療應(yīng)用的先進(jìn)方法。今后的研究應(yīng)著重于方法的發(fā)展、改進(jìn)、應(yīng)用和臨床試驗。通過實現(xiàn)circRNA疫苗的完整性，基于circRNA的新技術(shù)將為疾病治療和預(yù)防開辟新的方向。我們期待circRNA疫苗的成功臨床轉(zhuǎn)化。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41392-023-01561-x