枯草芽孢桿菌，學名Bacillus subtilis，是一種被廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)的革蘭氏陽性細菌。與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌沒有外層膜，分泌的蛋白能直接釋放到培養(yǎng)基中，是一種理想的原核蛋白分泌表達菌株。那么作為一種潛能巨大的原核表達系統(tǒng)，它究竟強在哪些方面呢？且讓AtaGenix為您一一道來。

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安全可靠

枯草芽孢桿菌的安全性是食品級的，收錄于FDA的GRAS菌中，歐洲食品安全局認為枯草芽孢桿菌可用于食品發(fā)酵。很多常用食品工藝中都能見到它的身影。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌的細胞壁組成簡單，只含肽聚糖和磷壁酸，在分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會混雜有類似革蘭氏陰性菌細胞壁成分中的熱源性脂多糖（內(nèi)毒素）等物質(zhì)。該表達系統(tǒng)用于藥用蛋白的表達純化時還可省掉去除內(nèi)毒素這一步。

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高產(chǎn)高效

同為原核生物界的明星，雖然大腸桿菌和枯草芽孢桿菌都只需短時間就可表達和積累大量目標蛋白。但大腸桿菌在后續(xù)發(fā)酵工藝中需要對收集的菌體進行破胞處理，而枯草芽孢桿菌得益于其本身所擁有的一套高效分泌信號肽及分子伴侶系統(tǒng)，只要簡單處理發(fā)酵上清就能得到較純的蛋白，并且表達的蛋白在多數(shù)情況下具有天然構(gòu)象和生物活性。

蛋白質(zhì)組學研究表明，枯草芽孢桿菌中至少有四種蛋白質(zhì)分泌途徑，其中Sec 分泌途徑是主要分泌途徑。另外枯草芽孢桿菌擁有良好的發(fā)酵生產(chǎn)技術，目前大部分商業(yè)化的蛋白水解酶和淀粉酶都是由其發(fā)酵得到的。AtaGenix擁有的 5 L、20 L、150 L及其他型號的發(fā)酵罐（上圖就是真相），可滿足各種大規(guī)模發(fā)酵的需求。

雖然枯草芽孢桿菌表達外源蛋白潛力無限，但也有其短板，如自身胞外蛋白酶對表達產(chǎn)物的降解、遺傳操作相對困難、外源蛋白有時得不到有效的表達等等。但AtaGenix卻能成功避免以上問題使外源目標蛋白在枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中有效表達，這主要得益于以下三個方面的優(yōu)勢：

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豐富的表達宿主

由于枯草芽孢桿菌沒有明顯的密碼子偏愛性，表達外源蛋白時無需對DNA序列進行優(yōu)化。在不同宿主中表達時，蛋白表達情況可能有差異。在AtaGenix擁有的多種枯草芽孢桿菌表達宿主中，1012 wild type宿主菌是最常用到的，可作為胞內(nèi)和胞外表達的通用菌；168 Marburg遺傳背景清楚，是研究枯草芽孢桿菌的標準菌株；AS1作為胞內(nèi)表達的備用菌株，常用于表達外源蛋白。而胞外蛋白酶缺陷菌株WB800N能有效解決由于枯草芽孢桿菌豐富的蛋白酶導致的蛋白表達產(chǎn)物降解問題。

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給力的表達載體

大部分的枯草芽孢桿菌不含內(nèi)源性質(zhì)粒，并且一般不能識別大腸桿菌中的啟動子。最初的枯草芽孢桿菌載體源于金黃色葡萄球菌，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定并易丟失?，F(xiàn)在普遍使用的質(zhì)粒載體是由枯草芽孢桿菌隱性質(zhì)粒與大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)成的穿梭載體，可在大腸桿菌中完成基因片段的連接克隆等遺傳操作，然后轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌進行外源基因的表達。AtaGenix使用的pHT系列載體擁有枯草芽孢桿菌的σA-依賴性的強啟動子，配以groE啟動子和lac操縱子，能夠通過IPTG誘導來啟動外源基因的表達。通過添加枯草芽孢桿菌中編碼α-淀粉酶的amyQ基因的信號肽編碼區(qū)域，構(gòu)成了能夠?qū)⒛繕说鞍子行Х置谥涟獾谋磉_載體，如pHT43。

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有效的轉(zhuǎn)化手段

枯草芽孢桿菌早期比較通用的轉(zhuǎn)化方法是Spizizen轉(zhuǎn)化法（接合轉(zhuǎn)化），但在枯草芽孢桿菌的生長周期中能自發(fā)形成感受態(tài)的菌株極少，并且感受態(tài)保存時間短暫。電轉(zhuǎn)化法操作簡單并且轉(zhuǎn)化率相對較高，AtaGenix通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件（上圖為AtaGenix實驗室的電轉(zhuǎn)儀實拍），將其用于枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化，可以有效縮短轉(zhuǎn)化時間并使轉(zhuǎn)化陽性率達到90%以上。

與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)還不是很完善，相信隨著對其研究的不斷深入，它在今后的發(fā)展中一定會大放光彩。畢竟，相對于真核表達系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)周期短、成本低、表達量較高這些優(yōu)勢還是很吸引人的。當然，AtaGenix也期待更多新的表達系統(tǒng)可以服務科研，造福人類。

The end