細(xì)胞不僅是生物實驗的重要材料，也是生物細(xì)胞實驗的基礎(chǔ)。大多數(shù)關(guān)于藥物、基因功能和疾病機制的研究都需要在細(xì)胞水平上進(jìn)行解釋。然而，細(xì)胞培養(yǎng)受人員操作和環(huán)境條件的影響很大。細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常會遇到很多細(xì)節(jié)問題，每個問題都可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗。本文總結(jié)了細(xì)胞實驗室多年來的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗與大家分享，希望對大家的細(xì)胞培養(yǎng)有所幫助。

1.細(xì)胞系的身份需要明確。

由于所選細(xì)胞系的某些特性符合研究方向的設(shè)定，因此我們選擇了某一細(xì)胞系進(jìn)行實驗。例如組織特征、疾病特征、功能特征、基因表達(dá)特征等。一旦使用了錯誤的細(xì)胞株，對我們研究結(jié)果的判斷就會產(chǎn)生很大的誤差和不確定性。

近幾年來，許多權(quán)威機構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞系的培養(yǎng)和流通過程中，存在著嚴(yán)重的交叉污染。據(jù)不完全統(tǒng)計，僅僅因為Hela細(xì)胞系統(tǒng)造成的污染就導(dǎo)致了3萬多篇論文結(jié)果的準(zhǔn)確性，而這種情況并不局限于Hela細(xì)胞。許多權(quán)威機構(gòu)的研究人員發(fā)現(xiàn)，超過451個細(xì)胞系統(tǒng)已被其他細(xì)胞完全吸收，46%的細(xì)胞污染被檢測到。可以看出，細(xì)胞交叉污染非常普遍。所以，在做實驗之前，驗證細(xì)胞株的正身是非常重要的。若是在機構(gòu)內(nèi)購買的細(xì)胞株，最好讓供應(yīng)商提供合格的STR鑒定報告。

目前，STR基因分類法是細(xì)胞交叉污染和性質(zhì)鑒定最有效、最準(zhǔn)確的方法之一，是ATCC等權(quán)威機構(gòu)認(rèn)可的黃金標(biāo)準(zhǔn)。不幸的是，并非所有細(xì)胞都可以通過STR進(jìn)行識別。目前，只有大多數(shù)人類細(xì)胞株和45種小鼠細(xì)胞株可以進(jìn)行識別。其它細(xì)胞株可結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、特性和物種鑒定進(jìn)行確認(rèn)。

二、培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇。

1.準(zhǔn)備工作：

根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特性，提前準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和血清。為了避免細(xì)胞在新環(huán)境下需要過渡適應(yīng)，最好遵循細(xì)胞原有的培養(yǎng)條件。與此同時，充分了解細(xì)胞的生長特性和形態(tài)特性，便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。

2.貼壁細(xì)胞的傳代：

1)移除使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。(不要直接倒出，以免造成瓶口殘留物污染)

2)用平衡鹽溶液(PBS)沖洗細(xì)胞，不含鈣鎂離子。輕輕地將沖洗液從與壁細(xì)胞層相對的容器一側(cè)加入，以免攪動細(xì)胞層，前后搖動容器數(shù)次，最后將沖洗液移除。(洗掉殘留的血清，避免影響胰酶的活性。)

3）以25cm2的培養(yǎng)瓶為例，在瓶中加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請根據(jù)每個細(xì)胞的指導(dǎo)使用適當(dāng)?shù)臐舛龋┫海p輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液在所有細(xì)胞表面流動，并在37℃下孵化。通常，在幾分鐘內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)量會收縮，細(xì)胞間隙會增加。傾斜培養(yǎng)瓶時，細(xì)胞層可以自然流下。此時，應(yīng)添加含有2-3ml血清的完整培養(yǎng)液，以終止消化（請參考每個細(xì)胞的指導(dǎo)方針進(jìn)行細(xì)胞分離所需的時間，建議每30秒在顯微鏡下觀察細(xì)胞分離）。此外，并非所有貼壁細(xì)胞都適合使用胰蛋白酶進(jìn)行解離，請根據(jù)每個細(xì)胞的指導(dǎo)選擇合適的解離方法。

4）傾斜培養(yǎng)瓶，吸收培養(yǎng)瓶中的液體，輕輕地沖向原細(xì)胞生長表面，重復(fù)這個動作2-3次，使所有細(xì)胞沿著瓶底流下，然后輕輕地將細(xì)胞吹成單個懸浮液（吹氣過程中應(yīng)避免氣泡）。

PS：對難以消化的細(xì)胞，盡量不要用力吹打來處理，以免對細(xì)胞造成物理損傷。先將消化后的細(xì)胞分離出來，及時停止消化。然后再次消化仍然靠近墻壁的細(xì)胞。實現(xiàn)分層消化，避免胰酶消化下易消化細(xì)胞長期受損。

5)將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移除上清。

6)加入新的含血清完全培養(yǎng)液，重新懸掛成單細(xì)胞懸液。按照各種細(xì)胞指引推薦的傳代比例，將細(xì)胞懸液均勻地分配到各種培養(yǎng)器皿中，補充新的含血清完全培養(yǎng)液，輕輕搖勻。

7)放入37℃孵化，第二天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況。

3.懸浮細(xì)胞的傳代：

由于懸浮生長細(xì)胞不靠近墻壁，因此在傳代過程中不需要使用酶消化法，而是可以直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。

1）直接傳代時，靜置5-10分鐘。懸浮細(xì)胞慢慢沉淀到容器底部后，吸收1/2-2/3的原始培養(yǎng)液，補充新鮮含血清的完整培養(yǎng)液，混合成細(xì)胞懸浮液。按照每個細(xì)胞指引推薦的傳代比例，將細(xì)胞懸液均勻地分配到每個培養(yǎng)器皿中，輕輕搖勻。

2)離心傳代時，將細(xì)胞和培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心時間為800-1000rpm3-5分鐘。去除上清后，加入新鮮的含血清完全培養(yǎng)液。按照各種細(xì)胞指引推薦的傳代比例，將細(xì)胞懸液均勻地分配到各種培養(yǎng)器皿中，補充新鮮的含血清完全培養(yǎng)液，輕輕搖勻。

3)放入37℃孵化，第二天在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況。

4.壁掛式懸浮混合細(xì)胞的傳代：

首先收集懸浮細(xì)胞，然后參考“貼壁細(xì)胞傳代”方法進(jìn)行消化收集，一起接種培養(yǎng)器皿。

PS：在懸浮細(xì)胞生長過程中，對細(xì)胞密度的要求一般較高，在培養(yǎng)過程中最好參考指南來控制細(xì)胞密度，不能過密或過稀。

5.細(xì)胞凍結(jié)：

1)按照“細(xì)胞傳代步驟”中的方法收集細(xì)胞。

2）加入細(xì)胞冷凍儲存液（一般為10%DMSO+相應(yīng)細(xì)胞的完整培養(yǎng)液），使細(xì)胞的最終密度為（5~10）×105/ml，并將其移入細(xì)胞冷凍儲存管。

3)程序冷卻(以需要異丙醇的Nalgene程序冷卻盒為例)：4℃30min→-80℃過夜→液氮。(4℃30min一定不能省略，否則凍存液不能滲透到細(xì)胞中，容易產(chǎn)生冰晶，造成細(xì)胞損傷。)

6.細(xì)胞復(fù)蘇：

1）取出儲存的細(xì)胞。液氮揮發(fā)后，立即在37℃的水浴中輕輕搖動以快速融化（通常在2分鐘內(nèi)，細(xì)胞狀態(tài)會隨著時間的推移而受到影響）。為了避免凍存管因溫差劇烈變化而爆裂，操作此步驟時請戴上防護面罩或防護目鏡。

PS：冷凍細(xì)胞用干冰運輸，收到后需立即放入深低溫冰箱或液氮中，至少3d后再進(jìn)行復(fù)蘇操作。

2)轉(zhuǎn)移到無菌控制臺，用75%酒精擦拭冷凍存管外部。

3)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含血清完全培養(yǎng)液離心管中，含血清預(yù)熱10-20ml，800-1000rpm離心3-5分鐘，將上清移除。

4)將含血清完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞重新加入預(yù)熱后，以約(3~5)×105/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。

5)放入37℃孵化，第二天在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況。

三、污染防治。

1.細(xì)菌污染。

細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染，主要是由于操作不慎或使用消毒不完全的耗材和試劑引入。最常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌和白葡萄球菌。鏡下形狀為長桿狀、短桿狀、顆粒狀等。

左邊是比較典型的桿菌污染，一般桿菌會延軸快速游動，量少時培養(yǎng)基會澄清。右邊的圖片是顆粒狀污染，一般培養(yǎng)基會渾濁或有白沙沉淀。

好氧細(xì)菌迅速增殖和分裂，培養(yǎng)基可在感染后24小時內(nèi)渾濁；厭氧細(xì)菌在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下緩慢增殖，觀察渾濁需要很長時間。

污染處理：由于抗生素在國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中的廣泛使用，污染后添加雙抗體（青霉素和鏈霉素、Penicillin+Streptomycin）通常無效。桿菌可以用100ug/ml慶大霉素治療一周，顆粒狀細(xì)菌可以用25ug/ml環(huán)丙沙星治療一周，效果比較好。

2.真菌污染。

煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染真菌。

左邊的圖片是典型的霉菌污染圖片，右邊的圖片是酵母污染，鏡子下可以看到明顯的發(fā)芽形態(tài)。

污染處理：可使用100ug兩性霉素B/T25瓶，治療一周。

注意：兩性霉素毒性較大，需要在細(xì)胞超過50%且狀態(tài)沒有受到很大影響之前進(jìn)行治療。

3.支原體污染。

支原體的危害：支原體污染能改變細(xì)胞的特性。例如，一些支原體會迅速消耗培養(yǎng)液中的精氨酸，并與細(xì)胞競爭營養(yǎng)，從而減緩或停止細(xì)胞的生長；同時，支原體還可以改變細(xì)胞的酶譜和細(xì)胞膜成分，導(dǎo)致細(xì)胞染色體異?；蚣?xì)胞病理變化。上述情況會嚴(yán)重影響使用這些細(xì)胞進(jìn)行實驗的結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)論不可靠。

(PCR法檢測細(xì)胞上清中的支原體污染)

支原體的預(yù)防和清除：由于支原體不能直接在鏡子下看到，因此需要通過PCR方法進(jìn)行檢測，因此污染后很難找到。建議每月對養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行一次檢測，并結(jié)合每周抽樣檢測，以便早期發(fā)現(xiàn)污染。對正在進(jìn)行支原體去除處理的細(xì)胞，建議每周進(jìn)行一次必要的檢查，直到出現(xiàn)陰性結(jié)果，并至少維持一個月。對不同細(xì)胞進(jìn)行分離處理，優(yōu)先對“支原體陰性”細(xì)胞進(jìn)行處理，然后對受感染的細(xì)胞進(jìn)行去除處理。與此同時，所有新引進(jìn)的細(xì)胞系都進(jìn)行了支原體檢測，以確保實驗室沒有新的污染。

4.預(yù)防和控制實驗室細(xì)胞污染。

建立良好的規(guī)章制度對減少細(xì)胞污染有很大幫助。包括準(zhǔn)入系統(tǒng)、操作規(guī)范和日常管理系統(tǒng)。

訪問系統(tǒng)：包括人員和材料。人員在進(jìn)入實驗室前需要進(jìn)行培訓(xùn)，并且必須符合穿著要求，如白大褂、隔離服、口罩、手套等。而且所需的物品，非一次性物品要嚴(yán)格消毒滅菌，而購買的物品要從正規(guī)、可靠的渠道購買。新購買的細(xì)胞在使用前應(yīng)進(jìn)行檢測和驗證。

操作規(guī)范：最好制定常規(guī)操作規(guī)范，實驗室人員應(yīng)遵循操作規(guī)范，不得隨意更改。同時，也是培養(yǎng)實驗人員良好的操作習(xí)慣。例如，槍頭滴管吸入后，不再再次伸入培養(yǎng)基中吸入，一次吸入足夠量的培養(yǎng)基。在加液時也要盡量做到懸空加液，這樣可以有效地防止支原體污染和細(xì)胞交叉污染。此外，如果可能的話，一次只能操作一個細(xì)胞，最好在細(xì)胞和細(xì)胞之間有一點時間間隔，以避免交叉污染。

日常管理制度：包括使用、清潔、維護等各方面的規(guī)則、方法，如環(huán)境和耗材試劑。還有試劑耗材等的消耗、庫存和采購管理，包括細(xì)胞樣品的二級庫存管理。對難以發(fā)現(xiàn)的污染源，最好定期檢測，主要是支原體污染和細(xì)胞交叉污染。

四、總結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)中常見的問題。

新購買或贈送的細(xì)胞。

1.如何處理新購買或贈送的細(xì)胞？

無論你購買的細(xì)胞還是禮物的細(xì)胞，當(dāng)你第一次得到它們時，你都應(yīng)該迅速做這些事情：檢查瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否泄漏，是否渾濁；是否有支原體污染；快速擴大冷凍儲存。

2.是否可以使用與原培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

沒有。每個細(xì)胞株都有自己的特定使用和適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。如果突然使用不同于原始培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基，大多數(shù)細(xì)胞無法立即適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞無法生存。

3.購買的細(xì)胞死亡或存活率差的可能原因？

常見原因可能有：培養(yǎng)基使用不當(dāng)或培養(yǎng)基質(zhì)量差；血清使用不當(dāng)或血清質(zhì)量差；解凍過程中的錯誤；冷凍細(xì)胞解凍后，清洗細(xì)胞并離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用不當(dāng)；培養(yǎng)箱的氣體濃度不能滿足要求；細(xì)胞在-80℃下放置時間過長。

恢復(fù)冷凍細(xì)胞。

4.為什么收到的冷凍管瓶體破裂，瓶蓋有裂紋，或者瓶蓋脫落？

冷凍管瓶蓋開裂或瓶體開裂可能是由于操作人員夾緊冷凍管時用力不當(dāng)造成的，導(dǎo)致冷凍管開裂。建議使用止血鉗仔細(xì)夾緊。此外，冷凍管瓶蓋松動或松動是由于熱膨脹和冷收縮造成的物理現(xiàn)象。冷凍管可能會造成細(xì)胞污染。因此，當(dāng)放入和取出液氮桶時，冷凍管應(yīng)立即再次擰緊。

5.冷凍管應(yīng)該如何解凍？

將冷凍管從液氮桶中取出解凍時，一定要注意安全，戴上防護眼鏡和手套，防止冷凍管爆裂。取出冷凍管后，應(yīng)立即放入37℃的水浴環(huán)境中快速解凍。輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)完全融化，以避免水滲入細(xì)胞，形成細(xì)胞內(nèi)的再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。并且注意水面不能超過冷凍管蓋的邊緣，否則容易發(fā)生污染。

6.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)立即去除DMSO？

目前，大多數(shù)實驗室將在解凍細(xì)胞后添加培養(yǎng)液來去除DMSO。然而，一些研究人員認(rèn)為，除了少數(shù)特別注明對DMSO敏感的細(xì)胞外，大多數(shù)細(xì)胞株（包括懸浮細(xì)胞）可以直接放入含有10~15毫升新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，第二天更換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO，以避免解凍后大多數(shù)細(xì)胞無法生長或附著的問題。