簡介

肝細胞癌 (HCC) 是一種異質(zhì)性疾病，預后不佳。然而，近年來，隨著基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展，我們對HCC分子發(fā)病機制的認識有了顯著提高。?對大量樣本進行高通量分析的累積數(shù)據(jù)表明，它可用于識別與 HCC 進展相關(guān)的關(guān)鍵生物標志物。然而，已知與 HCC 預后相關(guān)的生物標志物數(shù)量有限。

大約 18% 到 40% 的 HCC 患者報告了 CTNNB1 突變。?由突變的 CTNNB1 激活的致癌 Wnt/β-catenin 通路在肝臟代謝調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。?CTNNB1 突變的 HCC 具有獨特的代謝形態(tài)類型，通常為膽汁淤積且不常出現(xiàn)脂肪變性。?最近的一份報告顯示，參與不同代謝活動的蛋白質(zhì)，如藥物代謝、氨基酸代謝、糖酵解和糖異生，在 CTNNB1 突變腫瘤中富集，?11?表明它與代謝重編程密切相關(guān)。然而，潛在的機制尚不完全清楚。

代謝重編程是指細胞癌變過程中發(fā)生的代謝模式的顯著變化，涉及糖酵解、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、核酸代謝和脂肪酸代謝等多個過程。腫瘤發(fā)生是一個多步驟過程，涉及對促進不受控制的增殖和消除細胞死亡的途徑進行修改，這需要代謝重編程以提供用于細胞存活、生長和遷移的大分子。近年來，靶向代謝重編程已成為一種很有前景的新型治療策略，但HCC的代謝重編程尚未被破譯。

本研究通過癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫對 CTNNB1 突變型 HCC 和 CTNNB1 野生型 HCC 的基因集進行富集分析，發(fā)現(xiàn) CTNNB1 突變型 HCC 中顯著上調(diào)的基因集均與代謝有關(guān)，進一步證實了近CTNNB1突變與代謝重編程的關(guān)系。我們進一步探討了這些基因在 HCC 中的預后價值，并構(gòu)建了一個由五個代謝基因組成的預后風險模型。多個數(shù)據(jù)集（包括 TCGA、ICGC、GSE14520和GSE116174）的結(jié)果;?共 876 名 HCC 患者）表明該風險評分在評估 HCC 預后方面非常準確。此外，我們發(fā)現(xiàn)該預后模型可能反映腫瘤的免疫微環(huán)境，因此具有很高的臨床應用潛力。

結(jié)果

鑒定具有和不具有 CTNNB1 突變的 HCC 樣本之間的差異代謝基因組

盡管據(jù)報道 CTNNB1 突變 HCC 具有獨特的代謝特征，但相關(guān)的代謝基因仍然未知。?3?GSEA 顯示 CTNNB1 突變型 HCC 中顯著上調(diào)的基因組均與代謝途徑相關(guān)（NOM?P??< 0.05）（圖?1）。這些包括“細胞色素 P450 對異生物質(zhì)的代謝”（NES = 1.914，NOM?P??= 0.002），“藥物代謝 - 細胞色素 P450”（NES = 1.813，NOM?P??= 0.006），“過氧化物酶體”（NES = 1.767，NOM?P??= 0.02), '酪氨酸代謝' (NES = 1.758, NOM?P??= 0.01), '卟啉和葉綠素代謝' (NES = 1.745, NOM?P??= 0.002), '類固醇激素生物合成' (NES = 1.725, NOM?P??= 0.015) , '初級膽汁酸生物合成' (NES = 1.710, NOM?P??= 0.01), '氨?；?tRNA 生物合成' (NES = 1.707, NOM?P??= 0.02), '脂肪酸代謝' (NES = 1.707, NOM?P??= 0.04) , '抗壞血酸和醛酸代謝' (NES = 1.700, NOMP??= 0.01），“苯丙氨酸代謝”（NES = 1.62，NOM?P??= 0.02）和“精氨酸和脯氨酸代謝”（NES = 162，NOM?P??= 0.04）（表?1）。相反，在野生型 CTNNB1 HCC 中，沒有與代謝途徑相關(guān)的基因組顯著富集。

3.2.?在 TCGA 隊列中構(gòu)建預后模型

盡管 CTNNB1 已被證實是 HCC中?突變頻率最高的基因之一，但CTNNB1突變?型?HCC?中?顯著富集的代謝基因組是否影響?HCC?的預后尚不清楚?1、2、3、4、7、18?。通過單變量 Cox 回歸分析和 K-M 生存分析，我們確定了 14 個與 HCC 總生存期最相關(guān)的基因（表?2）。我們使用 Lasso 回歸和多 Cox 回歸進一步縮小模型基因的范圍以優(yōu)化模型。最后，構(gòu)建了由五個代謝基因組成的風險評分：風險評分 (RS) = CYP3A5 的標準化表達水平 * -0.00248 + ALAS1 的標準化表達水平 * -0.00445 + PRDX1 的標準化表達水平 * 0.003267 + GOT2 的標準化表達水平* -0.00887 + AMD1 的標準化表達水平 * 0.078805。TCGA 隊列的中位風險評分被用作劃分高風險組（RS > 1）和低風險組（RS < 1）的統(tǒng)一分界點。與低風險組相比，高風險組的 OS 明顯降低（圖?2A），預后模型在0.5、1、3和5年的ROC曲線下面積分別為0.834、0.779、0.724和0.731（圖?2B）。ALAS1、CYP3A5 和 GOT2 的表達水平在低風險組中較高，而 AMD1 和 PRDX1 的表達水平在高風險組中較高（圖?2C）。HCC 患者的死亡風險隨著風險評分的增加而增加（圖?2D-E）。單變量和多變量 Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)，風險評分可以獨立預測預后（圖?2F-G）。

?TCGA 隊列中預后模型的內(nèi)部驗證

患者根據(jù)AFP水平、血管侵犯、組織學分級、AJCC TNM分期、初始治療后新發(fā)腫瘤及個體腫瘤狀態(tài)等臨床特征分為12個亞組進行生存分析。在每個亞組中，高風險組的 OS 率似乎低于低風險組（圖?3A-F）。此外，該預后模型準確評估了134例復發(fā)患者的預后（其中肝內(nèi)復發(fā)65例，局部復發(fā)46例，肝外復發(fā)23例）。ROC曲線下面積在0.5、1、3和5年分別為0.824、0.692、0.746和0.780（圖?3H）。

在三個不同的獨立隊列中對預后模型進行外部驗證

為了驗證預后模型是否穩(wěn)健，我們使用了三個獨立的隊列（ICGC（n = 230）、GSE14520（n = 239）和GSE116174（n = 64））進行外部驗證。使用從 TCGA-HCC 隊列獲得的相同公式和截止值，將患者分配到高風險組和低風險組。與 TCGA 的結(jié)果一致，高風險組的 OS 顯著低于低風險組（圖?4A-C）。在 ICGC 隊列中，0.5、1、3 和 5 年的 ROC 曲線下面積分別為 0.705、0.759、0.718 和 0.750（圖?4D）。在GSE14520隊列中，0.5、1、3 和 5 年的 ROC 曲線下面積分別為 0.762、0.712、0.687 和 0.663（圖?4E）。在GSE116174隊列中，0.5、1、3 和 5 年的 ROC 曲線下面積分別為 0.722、0.662、0.601 和 0.647（圖?4F）。如單變量和多變量 Cox 回歸分析所示，風險評分可以獨立預測每個隊列的預后（圖?4G-I）。這些結(jié)果表明我們構(gòu)建的預后模型能夠普遍應用。

風險評分與臨床病理特征的關(guān)系

既往研究表明，AFP 水平、組織學分級、臨床分期（TNM、BCLC 和 CLIP）、腫瘤直徑和血管侵犯與 HCC 的預后相關(guān)。?19?,?20?,?21?,?22?本研究利用四個獨立隊列的臨床數(shù)據(jù)分析了風險評分與預后因素之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，較高的風險評分與較高的 AFP 水平、較高的組織學分級、較大的腫瘤直徑、血管侵犯和晚期臨床分期（TNM、BCLC 和 CLIP）顯著相關(guān)（圖?5）。我們還對不同風險組進行了卡方檢驗，以進行臨床特征的相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，兩組在臨床分期、組織學分級、腫瘤數(shù)量、AFP水平和生存狀態(tài)方面存在顯著差異（表?3,,4,4,,5,5,,66）。

基因本體功能富集分析

我們使用 Gene Ontology (GO) 功能富集分析來注釋 DEG 的功能（圖?6A) 在高風險組和低風險組中。結(jié)果表明，在高風險組中顯著上調(diào)的基因與多種免疫調(diào)節(jié)過程相關(guān)，包括調(diào)節(jié)淋巴細胞活化、調(diào)節(jié)免疫效應過程和體液免疫反應（圖?6B）。TIMER法對免疫細胞浸潤的估計顯示，高危組6種免疫細胞浸潤水平均高于低危組（圖?6C），表明預后特征可能通過調(diào)節(jié)腫瘤的免疫微環(huán)境影響HCC患者的預后。

風險評分與免疫細胞浸潤的關(guān)系

我們進一步分析了預后模型與免疫細胞浸潤的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)風險評分與六種免疫細胞浸潤呈正相關(guān)：CD4 T 細胞（r??= 0.175，P??= 0.001）、CD8 T細胞 (?r??= 0.295,?P??< 0.001)、B 細胞 (?r??= 0.256,?P??< 0.001)、巨噬細胞 (?r??= 0.472,?P??< 0.001)、樹突細胞 (?r??= 0.412,?P??< 0.001) 和中性粒細胞 (?r??= 0.448,?P??< 0.001) (圖?7A）。CTNNB1 突變的 HCC 以免疫排斥為特征，?23?最近的一項臨床研究表明，該亞組對免疫檢查點抑制劑的治療不敏感。?8?我們的研究發(fā)現(xiàn)，風險評分與六個主要免疫檢查點（PDL1、LAG3、CTLA4、CD276、PDCD1 和 TIGIT）的表達水平呈正相關(guān)（圖?7B)，這與 CTNNB1 突變亞組的風險評分一致，低于非突變亞組的風險評分（圖?7C）。

風險評分與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系

我們使用 ssGSEA 進一步探索預后模型與腫瘤免疫微環(huán)境 (TIME) 之間的內(nèi)部關(guān)系。在免疫細胞浸潤方面，在四個獨立隊列中，高危組的 Tregs、aDCs、Th2 細胞和巨噬細胞的豐度顯著高于低危組（圖S1A-D）。在免疫功能方面，結(jié)果顯示低風險組的 II 型 IFN 反應明顯強于低風險組（圖S1A-D）。此外，免疫檢查點相關(guān)基因組的表達在高危組中上調(diào)，這與之前的結(jié)果一致（圖S1A-B）。

材料和方法

2.1。從 TCGA 收集數(shù)據(jù)

我們從 TCGA 網(wǎng)站 (?https://portal.gdc.cancer.gov/repository?) 獲得了 374 個 HCC 樣本的序列數(shù)據(jù)。相應的臨床資料包括總生存時間、生存狀態(tài)、性別、年齡、種族、甲胎蛋白（AFP）水平、體重指數(shù)（BMI）、血管侵犯、組織學分級、AJCC TNM分期、癌癥家族史、腫瘤史從 UCSC Xena 網(wǎng)站 (?https://xenabrowser.net/?)獲得 TCGA 隊列的初始治療后新腫瘤的存在和個體腫瘤狀態(tài)。CTNNB1 突變樣本列表來自 cBioPortal 網(wǎng)站 (?https://www.cbioportal.org/?)。我們保留了平均表達值大于 1 的基因，同時去除了低豐度的 RNA 測序數(shù)據(jù)。?15?,?16?本研究符合 TCGA 的發(fā)表要求 (?http://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines?)。

2.2.?從 ICGC 和 GEO 收集數(shù)據(jù)

三個獨立的隊列用于外部驗證（ICGC-LIRI-JP、GSE14520和GSE116174）。我們獲得了基因表達文件（來自Illumina HiSeq RNA-seq平臺的ICGC-LIRI-JP基因表達文件，來自GPL571平臺的GSE14520基因表達文件和來自GPL13158平臺的GSE116174基因表達文件）和來自基因表達的相應臨床數(shù)據(jù)綜合 (GEO) 數(shù)據(jù)庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/?)和國際癌癥基因組學聯(lián)盟 (ICGC?,?https://icgc.org/?）。通過 SVA R 包（R Core Team，R Foundation for Statistical Computing，Vienna，Austria）中包含的戰(zhàn)斗功能消除了 RNA-seq 數(shù)據(jù)集的批次效應。下載的配置文件均符合 GEO 和 ICGC 數(shù)據(jù)訪問規(guī)則。

2.3.?基因集富集分析（GSEA）

本研究利用基因集富集分析來揭示 TCGA 隊列中 CTNNB1 突變組 (n = 98) 和非突變組 (n = 276) 之間代謝相關(guān)基因的差異。選擇帶注釋的基因集文件（c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt）作為參考。閾值被確認為 NOM?P值 < 0.05。

2.4.?代謝相關(guān)預后模型的構(gòu)建和驗證

我們首先使用單變量 Cox 回歸和 Kaplan-Meier (K-M) 對每個基因進行生存分析，并選擇兩種算法中P??< 0.05 的基因作為候選基因來構(gòu)建模型。?17?接下來，Lasso 回歸分析有助于進一步縮小候選基因數(shù)量。最后，我們構(gòu)建了一個風險評分系統(tǒng)，將每個代謝基因表現(xiàn)出的歸一化表達水平與從多變量 Cox 回歸分析中獲得的回歸系數(shù)相乘。TCGA 隊列（n = 343）的中位風險評分用于對高風險組和低風險組進行分類。Kaplan-Meier (K-M) 生存分析（對數(shù)秩檢驗）與時間相關(guān)的受試者工作特征曲線 (ROC) 分析一起用于評估上述四個獨立隊列中預后模型所表現(xiàn)出的預測能力（ TCGA、ICGC、GSE14520和GSE116174）。本研究進行了單變量和多變量 Cox 回歸分析，以確認風險評分是否可以獨立預測預后。P??< 0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。R包'survminer'中的K-M方法用于生成生存曲線，R包'survivalROC'用于生成ROC曲線。需要指出的是，為了避免其他因素對患者預后的影響，我們排除了生存時間小于1個月的患者。

2.5.?臨床病理參數(shù)與風險評分的相關(guān)性分析

我們使用 Wilcoxon 符號秩檢驗（2 組）或 Kruskal-Wallis 檢驗（>=2 組）分析臨床病理學（包括 AJCC TNM 分期、Barcelona 分期、CLIP 分期、主要腫瘤大小、腫瘤分化、AFP和血管腫瘤細胞類型）和風險評分。P??< 0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義，箱線圖是通過 R 軟件中實現(xiàn)的 beeswarm 包生成的。

2.6.?不同風險組之間差異表達基因 (DEG) 的鑒定

使用 R 包“l(fā)imma”中的 Wilcoxon 測試方法檢查了兩個 HCC 組的組織中的 DEG。閾值被確認為 |log2 倍變化 (FC)|?> 1.0 和 FDR < 0.05?；虮倔w（GO）富集分析進一步用于使用 R 包“clusterProfiler”對 DEG 進行生物學功能注釋。

2.7.?評估不同風險組的免疫細胞浸潤

從腫瘤免疫評估資源（TIMER）網(wǎng)站下載HCC患者免疫細胞浸潤水平的相關(guān)數(shù)據(jù)，比較TCGA數(shù)據(jù)集中不同風險組之間的免疫細胞浸潤水平。采用單樣本基因集富集分析（ssGSEA，由 29 個免疫相關(guān)基因集代表的免疫細胞類型、功能和通路）來量化免疫細胞、功能或通路在高、低基因組中的活性或富集水平。來自四個獨立隊列的風險樣本。從 ssGSEA 計算的歸一化富集分數(shù) (NES) 用于“GSVA”和“GSEABase”R 包中。采用獨立樣本 t 檢驗比較高危組和低危組之間免疫浸潤水平和免疫功能的差異，以及建議P值 < 0.05 具有統(tǒng)計學意義。

2.8.?統(tǒng)計分析

R 軟件 v3.6.1（R Foundation for Statistical Computing，Vienna，Austria）與 GraphPad Prism v7.00（GraphPad Software Inc，USA）一起協(xié)助進行統(tǒng)計分析。Fisher 精確檢驗或 Pearson 卡方檢驗有助于分析定性變量。定量變量的分析依賴于非參數(shù) Wilcoxon 秩和檢驗（對于未配對樣本）。應用 Kruskal-Wallis 檢驗對多個組進行歸一化。如果以上未指定，則認為P??< 0.05 具有統(tǒng)計學意義。

討論

在過去的幾十年中，在了解 HCC 的危險因素和分子特征方面取得了相當大的進展。?24?,?25?,?26?然而，許多國家的發(fā)病率和癌癥特異性死亡率繼續(xù)增加。?26?,?27?現(xiàn)有的預后分期系統(tǒng)在指導準確治療和預測更準確的臨床結(jié)果方面仍有許多局限性。?28?,?29?我們需要利用基因測序技術(shù)進一步完善現(xiàn)有的預后分期系統(tǒng)，讓患者受益于精準治療。?8?越來越多的證據(jù)表明，代謝重編程可以顯著影響 HCC 的發(fā)展，并可能與晚期疾病和不良臨床結(jié)果有關(guān)?30?,?31?；因此，靶向腫瘤代謝似乎有助于有效治療 HCC。

最近的一份報告發(fā)現(xiàn)，參與藥物代謝、糖異生、糖酵解和氨基酸代謝等不同代謝活動的蛋白質(zhì)在 CTNNB1 突變型 HCC 中富集。?11?NRF2突變是HCC發(fā)生的早期事件，被認為是促進癌前肝細胞進展為HCC的重要因素。?32?現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，NRF2 信號通路的異常轉(zhuǎn)導與辛伐他汀有關(guān)。?33?,?34?相比之下，CTNNB1突變通常發(fā)生在HCC進展的后期，對其具體機制的相關(guān)研究尚缺乏?？紤]到這一點，我們在 TCGA 數(shù)據(jù)庫中對 mRNA 表達譜進行了 GSEA。根據(jù)CTNNB1是否突變，將374個腫瘤組織分為兩組，其中突變98個，未突變276個。有趣的是，突變組中顯著富集的基因與 12 條代謝途徑相關(guān)。我們采用單變量Cox回歸、K-M生存分析、Lasso回歸和多Cox回歸逐步分析代謝基因，最終構(gòu)建了五種代謝基因（包括AMD1、PRDX1、ALAS1、CYP3A5和GOT2）風險評分模型.?考慮到統(tǒng)一的風險評分公式和風險分類的閾值，將所有納入的患者分為高風險組和低風險組。我們首先根據(jù) TCGA 隊列的臨床特征（例如初始治療后是否存在新腫瘤、個體腫瘤狀態(tài)、AJCC 分期、組織學分級、血管侵犯和 AFP 水平）對預后模型進行了內(nèi)部驗證。然后將患者分為12個亞組。根據(jù) K-M 生存曲線，在每個亞組中，高風險組的 OS 明顯低于低風險組。隨后，我們通過使用三個獨立隊列ICGC（n = 230）對預后模型進行了外部驗證，我們首先根據(jù) TCGA 隊列的臨床特征（例如初始治療后是否存在新腫瘤、個體腫瘤狀態(tài)、AJCC 分期、組織學分級、血管侵犯和 AFP 水平）對預后模型進行了內(nèi)部驗證。然后將患者分為12個亞組。根據(jù) K-M 生存曲線，在每個亞組中，高風險組的 OS 明顯低于低風險組。隨后，我們通過使用三個獨立隊列ICGC（n = 230）對預后模型進行了外部驗證，我們首先根據(jù) TCGA 隊列的臨床特征（例如初始治療后是否存在新腫瘤、個體腫瘤狀態(tài)、AJCC 分期、組織學分級、血管侵犯和 AFP 水平）對預后模型進行了內(nèi)部驗證。然后將患者分為12個亞組。根據(jù) K-M 生存曲線，在每個亞組中，高風險組的 OS 明顯低于低風險組。隨后，我們通過使用三個獨立隊列ICGC（n = 230）對預后模型進行了外部驗證，與低風險組相比，高風險組的 OS 明顯降低。隨后，我們通過使用三個獨立隊列ICGC（n = 230）對預后模型進行了外部驗證，與低風險組相比，高風險組的 OS 明顯降低。隨后，我們通過使用三個獨立隊列ICGC（n = 230）對預后模型進行了外部驗證，GSE14520?(n = 239) 和GSE116174（n = 64）。與 TCGA 結(jié)果一致，高風險組的預后明顯低于低風險組。正如單變量和多變量 Cox 回歸分析所證明的那樣，該預后模型可以獨立預測 HCC 的預后。這些結(jié)果支持我們的預后模型具有很強的普遍適用性。GO富集分析表明，高危組中表達上調(diào)的基因與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。具有浸潤性巨噬細胞的腫瘤與風險評分之間的相關(guān)性最為突出。眾所周知，巨噬細胞在腫瘤組織中含量最多，對腫瘤有明顯的調(diào)節(jié)作用，能夠促進腫瘤細胞的增殖，?35?,?36?,?37?正如預期的那樣，風險評分與六個常用免疫檢查點（PDL1、LAG3、CTLA4、CD276、PDCD1 和 TIGIT）的表達水平呈正相關(guān)。我們得出結(jié)論，免疫抑制性腫瘤微環(huán)境可能是導致高風險組預后不良的主要因素。值得注意的是，風險評分與新興的免疫檢查點 CD276 (B7-H3) 密切相關(guān)，最近有報道稱其在多種人類實體癌中高度過表達，并且通常與患者的不良臨床結(jié)果相關(guān)，使其成為腫瘤免疫治療的潛在靶點。?38?,?39?此外，高危評分可反映與生存結(jié)局相關(guān)的不良臨床特征，如 AFP 水平（>300 ng/mL）、腫瘤血管侵犯、低腫瘤分化、晚期 AJCC 分期、晚期 BCLC 分期、晚期 CLIP 分期、新發(fā)腫瘤初始治療后，主要腫瘤大小> 5 cm和多發(fā)腫瘤，這也可能有助于解釋高危患者預后不良的原因。

腺苷甲硫氨酸脫羧酶 1 (AMD1) 是影響多胺（包括精胺）生物合成的必需酶。Zabala-Letona 發(fā)現(xiàn) AMD1 的上調(diào)可以激活 PTEN-PI3K-mTORC1 通路來維持前列腺癌細胞的生長和增殖。?40?此外，Xu 報道 AMD1 對人胃癌的預后具有致瘤作用，但 AMD1 在 HCC 中的潛在功能仍不清楚。?41?Peroxiredoxin 1 (PRDX1) 作為抗氧化酶的過氧化物酶家族成員。Fang Y 和 Sun 等發(fā)現(xiàn) PRDX1 在 HCC 組織中的高表達對應于不良的臨床結(jié)果，其機制可能與促進腫瘤血管生成和調(diào)節(jié)細胞遷移和侵襲有關(guān)。?42?,?43?5'-氨基乙酰丙酸合成酶 1 (ALAS1) 在血紅素生物合成過程中起限速酶的作用。最近進行的研究表明，ALAS1 可以影響許多細胞功能，并對非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌和口腔癌有重要影響。?44、45?然而，?ALAS1?在 HCC 中的作用仍不為人所知。CYP3A5 是一種細胞色素 P450 蛋白，在肝臟中許多致癌物質(zhì)和抗癌藥物的代謝中發(fā)揮作用。江等人發(fā)現(xiàn)CYP3A5通過調(diào)節(jié)mTORC2/Akt信號通路在HCC中發(fā)揮抗腫瘤作用。?46?近年來，谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶 2 ( GOT2?) 被多次報道與胰腺癌的進展有關(guān)，47、48?但?其在 HCC 中的作用仍不清楚。

盡管上述研究支持我們的預后模型具有很高的臨床應用潛力，但該研究面臨一些局限性。盡管從大量樣本中積累的高通量分析數(shù)據(jù)得到了優(yōu)化應用，但還需要通過前瞻性研究進一步驗證。此外，HCC 中五個基因的特定生物學功能需要通過實驗來探索。