質(zhì)粒擴增是分子實驗室的基本技能，但對于剛進(jìn)實驗室的小伙伴來說還是會手忙腳亂。今天小編就此整理了質(zhì)粒擴增的常規(guī)步驟供大家參考。

實驗試劑及儀器

DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB液體及固體培養(yǎng)基，抗生素；移液槍，離心管，無菌培養(yǎng)皿，恒溫水浴鍋，離心機，超凈工作臺

操作步驟

1.? 從-80℃冰箱中取出100 μl感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化；

2.? 快速加入2 μl質(zhì)粒溶液，即大約1μg質(zhì)粒，輕輕搖勻；

3.? 冰浴30min，同時將水浴鍋預(yù)熱至42℃；

4.??置于42℃水浴鍋中熱激45-90s（一般90s），熱激過程中不要移動離心管；

5.? 馬上冰浴3-5min；

6.?向離心管中加入1ml 無抗性LB液體培養(yǎng)基，吹打混勻后于37℃搖床200rpm/min，振蕩培養(yǎng)1 h，可見輕度渾濁；細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒中的抗生素抗性基因；

7.??接著5000-6000 rpm/min離心5 min；

8.? 棄上清900μl，留100 μl液體重懸細(xì)菌；

9.??提前準(zhǔn)備好帶相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基，在37℃孵箱預(yù)熱；

10.? 將100μl重懸細(xì)菌接種至含抗生素的固體培養(yǎng)基上，用接種環(huán)涂布均勻；

11.??接種后。正面向上防止30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，于37℃孵箱培養(yǎng)12-16 h；

12.??挑克隆，用槍頭將克隆菌挑出，接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中；

13.??37℃搖床200rpm/min，培養(yǎng)12-16 h，可見菌液渾濁；

14.??離心收集后，使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

注意事項

1、? 一般來說質(zhì)粒DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%；

2、? 整個操作過程需在無菌條件下進(jìn)行；

3、? 熱激時間不宜過長或過短，動作輕柔；

4、? 抗生素的工作濃度參考試劑附帶的說明書，一般Amp+或Kan+的工作濃度約為50μg/ml。

5、? 如果提取質(zhì)粒后續(xù)需要轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒提取試劑盒務(wù)必選擇去內(nèi)毒素的。