蛋白質(zhì)組學(xué)代表了某些細(xì)胞、組織或器官的表達(dá)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，已成為我們了解人類疾病和癌癥分子機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要手段。人體中的蛋白質(zhì)水平處于穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，蛋白質(zhì)的積累通常會(huì)導(dǎo)致生物體質(zhì)的變化，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或疾病。因此，蛋白質(zhì)定量對(duì)于機(jī)理研究具有重要意義。本文就目前流行的蛋白質(zhì)定量技術(shù)及其在臨床研究中的應(yīng)用作一概述。

基于HPLC-MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

基于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展主要取決于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析設(shè)備、樣品分離和制備技術(shù)、鑒定以及生物信息學(xué)。目前，shotgun鳥槍法是最常用的大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定策略。如下圖所示，在自下而上分析策略中，蛋白質(zhì)通過蛋白水解酶水解成肽的混合物，然后通過色譜法或親和分離技術(shù)進(jìn)行分離，最后通過質(zhì)譜檢測(cè)碎裂離子。通過數(shù)據(jù)庫搜庫將質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)理論消化產(chǎn)生的譜進(jìn)行匹配，并根據(jù)一系列指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，實(shí)現(xiàn)肽譜匹配（PSM），并最終完成蛋白質(zhì)組鑒定。而在基于自上向下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略中，可以直接從樣品中分離和檢測(cè)完整的蛋白。與自下而上的方法相比，自上向下分析策略能提供更多保存蛋白物種的信息。這兩種分析策略促進(jìn)了疾病和癌癥的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

蛋白質(zhì)組學(xué)常用定量技術(shù)及其臨床應(yīng)用

Label-free定量（LFQ）

Label-free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)由于簡單且侵入性最低而成為目前使用最廣的蛋白質(zhì)組定量策略。該技術(shù)不涉及其他生物分子，既方便又經(jīng)濟(jì)。但是，研究人員只能通過label-free定量方法獲得蛋白質(zhì)的相對(duì)數(shù)量。Label-free定量在臨床研究中經(jīng)常用于篩選腫瘤生物標(biāo)志物，通常將腫瘤鄰近組織或正常組織作為對(duì)照組。De Oliveira等人發(fā)現(xiàn)MMP-7是一種有前景的生物標(biāo)志物，與通過label-free定量結(jié)果有效診斷胃腺癌患者有關(guān)。尿E-鈣粘蛋白是發(fā)現(xiàn)糖尿病患者早期腎臟損傷的標(biāo)志物。在Sun等人的研究中，采用label-free定量分析系統(tǒng)地比較了健康受試者和肺癌患者唾液和血清外泌體中的蛋白質(zhì)譜，并發(fā)現(xiàn)了潛在的肺癌生物標(biāo)志物。

真皮蛋白、載脂蛋白D、聚脂素、催乳素誘導(dǎo)蛋白和血清白蛋白是靶向蛋白質(zhì)組學(xué)和無標(biāo)記定量質(zhì)譜研究中最豐富的汗液分泌蛋白，為形成皮膚化學(xué)屏障提供了潛在的汗液生物標(biāo)志物。label-free定量還用于檢測(cè)其他疾病和腫瘤的生物標(biāo)志物，如帕金森病的Vps35、肝細(xì)胞癌的SOAT1、前列腺癌的GOT2、膀胱癌的A1AT。

細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（SILAC）

SILAC是一種體內(nèi)代謝標(biāo)記法，無論對(duì)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量還是相對(duì)定量都具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。SILAC法將賴氨酸（13C或15N）和精氨酸（13C或15N）的同位素添加到缺少賴氨酸和精氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基中，將蛋白質(zhì)標(biāo)記為輕型和重型。通過質(zhì)譜檢測(cè)到的MS1水平進(jìn)行定量分析，如下圖。Fricke等人使用SILAC定量檢測(cè)了TGFBR2缺乏性大腸癌中胞外囊泡的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)了48個(gè)TGFBR2調(diào)控蛋白。SILAC策略常用于識(shí)別蛋白質(zhì)和氨基酸的翻譯后修飾（PTM），例如，Peng等發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中，過表達(dá)RNF38可通過泛素化和降解AHNAK促進(jìn)TGF-β信號(hào)通路。Zhang等人通過SILAC定量比較了具有不同侵襲能力的食管鱗狀細(xì)胞癌的組蛋白H3和H4的翻譯后修飾，他們的研究有助于理解組蛋白翻譯后修飾在不同的侵襲性ESCC細(xì)胞系中的不同表達(dá)。隨著SILAC技術(shù)的發(fā)展，通過標(biāo)記整個(gè)生物并將其組織用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)現(xiàn)了基于SILAC的模型生物組織定量蛋白質(zhì)組學(xué)，從而闡明了SILAC在臨床研究中的應(yīng)用。

相對(duì)和絕對(duì)定量等重同位素標(biāo)簽法（iTRAQ）

iTRAQ是由美國ABI公司于2004年開發(fā)的。依靠iTRAQ試劑盒，可以一次性標(biāo)記多達(dá)8個(gè)樣品，iTRAQ試劑包含報(bào)告基團(tuán)、肽反應(yīng)基團(tuán)和平衡基團(tuán)。報(bào)告基團(tuán)的分子量為113Da至121Da，相關(guān)的平衡基團(tuán)的分子量為32Da ~24Da，總分子量為145Da。iTRAQ技術(shù)可以比較不同樣品中的蛋白質(zhì)，具有良好的重現(xiàn)性和高靈敏度?？赏瑫r(shí)進(jìn)行定性和定量分析。iTRAQ技術(shù)已在越來越多的領(lǐng)域中得到應(yīng)用，如在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中，iTRAQ可以分析和鑒定腫瘤組織中的差異蛋白以尋找生物標(biāo)志物。Hjelle Sigrun闡述了iTRAQ在髓樣白血病分子治療靶標(biāo)中的應(yīng)用。Hu等人在肝損傷中鑒定了兩個(gè)標(biāo)志物，含量升高的膜結(jié)合的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（MB-COMT）和含量減少的視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）。

串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT）

TMT法由Thermo Fisher公司開發(fā)，TMT可以同時(shí)定量多達(dá)16個(gè)樣品。如下圖所示，TMT試劑也包含報(bào)告分子、標(biāo)準(zhǔn)化分子和胺反應(yīng)性基團(tuán)。TMT旨在在不犧牲蛋白質(zhì)鑒定和蛋白質(zhì)定量質(zhì)量目標(biāo)的情況下進(jìn)一步增加能夠同時(shí)分析的樣品數(shù)量，并且其定量準(zhǔn)確性更高。TMT也廣泛應(yīng)用于臨床樣本研究，Wu等人應(yīng)用TMT標(biāo)記了10例HCC患者的樣本，發(fā)現(xiàn)纖溶酶原是HBV相關(guān)的慢性肝衰竭的預(yù)后生物標(biāo)志物。在胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中也可采用類似的分析策略。

除上述這些常用方法外，很多其他策略也可以用于定量蛋白質(zhì)，例如差異凝膠電泳（DIGE）、同位素編碼的親和標(biāo)記（iCAT）和SWATH。這些方法也可用于研究分子機(jī)制和生物標(biāo)記。蛋白質(zhì)定量技術(shù)對(duì)于尋找人類癌癥的生物標(biāo)志物、藥物靶點(diǎn)選擇和機(jī)制研究至關(guān)重要。這些技術(shù)十分強(qiáng)大，可以幫助研究疾病發(fā)生和腫瘤進(jìn)展的機(jī)制，以及發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記并闡明臨床研究。