基本定義

上期我們具體介紹了免疫沉淀技術(shù)，本期將繼續(xù)帶大家了解一下其衍生技術(shù)—免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）。免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法都具有一個(gè)共同的基礎(chǔ)，即抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，所以Co-IP也不例外。Co-IP是研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法，由于是在非變性條件下研究的，因此可以反映蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)互作的真實(shí)狀態(tài)。適用于研究?jī)蓚€(gè)已知蛋白之間的相互作用關(guān)系，也可以提供已知蛋白去尋找與之相互作用的未知蛋白。

實(shí)驗(yàn)原理

?????? 在非變性條件下裂解細(xì)胞，以保留活細(xì)胞中許多蛋白-蛋白相互作用的復(fù)合物。若要研究細(xì)胞內(nèi)蛋白A和蛋白B之間是否存在相互作用，可將已知的目的蛋白A作為誘餌蛋白，用蛋白A的特異性抗體對(duì)蛋白A進(jìn)行免疫沉淀，如果蛋白A和B之間存在相互作用，那么B也會(huì)隨之沉淀下來。然后采用western blot檢測(cè)沉淀中是否含有蛋白B，如果能檢測(cè)到，說明蛋白A和B之間存在相互作用；反之則不存在相互作用。

圖 Co-IP?實(shí)驗(yàn)原理示意圖

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

1、? 確定兩種已知蛋白之間是否存在相互作用；

2、? 確定兩種蛋白相互作用的結(jié)合位點(diǎn)；

3、? 探索與特定蛋白相互作用的未知蛋白；

4、? 分離天然狀態(tài)的蛋白復(fù)合物。

研究?jī)蓚€(gè)已知蛋白之間的相互作用關(guān)系時(shí)，也可以將蛋白標(biāo)簽與目的蛋白融合，相當(dāng)于給已知蛋白貼上特定的標(biāo)簽，通過標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫沉淀、檢測(cè)沉淀復(fù)合物中標(biāo)簽的存在與否來反映目的蛋白之間的互作情況。這種方法非常適合用于外源性構(gòu)建目的基因截短體，來研究與互作蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)榈鞍捉囟腆w可能會(huì)失去抗體的抗原表位，而無法與其抗體特異性結(jié)合，此時(shí)融合標(biāo)簽蛋白，就能很方便地對(duì)截短體進(jìn)行標(biāo)記。此外，若目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平較低，會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)不到的可能，因此建議通過表達(dá)載體來過表達(dá)目的基因，以提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度。

一般實(shí)驗(yàn)流程

1、? 樣本制備：離心收集細(xì)胞后，加入適量預(yù)冷的非變性細(xì)胞裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，冰上靜置15-30min，充分裂解細(xì)胞，4℃離心后取上清；

2、? 誘餌蛋白抗體孵育：取少量細(xì)胞裂解的上清以備western blot分析，其余的上清液加入相應(yīng)蛋白的抗體（適用于IP），置于4℃搖床孵育過夜。

3、? 沉淀免疫復(fù)合物：將一定量預(yù)處理過的protein A/G瓊脂糖珠加入經(jīng)抗體孵育的裂解液，繼續(xù)于4℃搖床孵育2-4h或過夜，離心后棄上清，保留沉淀，并將沉淀洗滌3次。最后加入適量loading buffer煮5-10min。

4、? 蛋白檢測(cè)：處理好樣本后即可用于SDS-PAGE、western blot或質(zhì)譜分析。

Co-IP的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)

??? 操作流程簡(jiǎn)單

??? 得到的蛋白都是天然狀態(tài)下的，經(jīng)過翻譯后修飾的

??? 也能夠捕獲間接相互作用的蛋白

缺點(diǎn)

??? 低親和力和瞬時(shí)互作的蛋白不能被檢測(cè)到

??? 無法判斷蛋白間是直接還是間接相互作用

??? 實(shí)驗(yàn)前需要預(yù)測(cè)互作靶蛋白，以選用相應(yīng)的抗體做檢測(cè)，此法對(duì)于western blot檢測(cè)有一定的風(fēng)險(xiǎn)

??? 可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，需設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照

以上我們對(duì)Co-IP實(shí)驗(yàn)做了基本的介紹，下一期小編進(jìn)一步對(duì)Co-IP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果做分析并通過文獻(xiàn)案例給大家分享。漢恒生物可為大家提供多種蛋白標(biāo)簽，支持Co-IP等實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用，歡迎聯(lián)系咨詢~