簡介：

A549細(xì)胞系是于1972年建立的人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系?？茖W(xué)家通過一位58歲的白種人男性的腺癌肺組織的外植體腫瘤轉(zhuǎn)移并培養(yǎng)了該細(xì)胞系。在肺組織中發(fā)現(xiàn)的A549細(xì)胞是鱗狀細(xì)胞，負(fù)責(zé)水和電解質(zhì)在整個肺泡中的擴散，還可以通過胞磷膽堿途徑合成含有高度不飽和的脂肪酸和卵磷脂。相比之下與小細(xì)胞肺癌（SCLC），該細(xì)胞系的侵襲性較小且擴散速度較慢，但事實證明它更為普遍，占所有肺癌病例的85-88％。 A549細(xì)胞已成為II型肺泡上皮細(xì)胞的基因敲除細(xì)胞模型，這意味著A549 KO細(xì)胞系可用于研究肺組織的代謝過程以及藥物向組織的可能傳遞機制。該細(xì)胞系目前被用作體外和體內(nèi)模型，通過一些基因編輯技術(shù)（例如CRISPR / Cas 9）研究肺癌和正在開發(fā)的藥物療法，這使A549成為適合基因敲除的細(xì)胞系。基因敲除的定制過程。

A549細(xì)胞的快速繁殖可以歸因于環(huán)氧合酶2的顯著表達(dá)。在體外培養(yǎng)A549細(xì)胞時，它們通常會生長成附著或緊密依附著培養(yǎng)基的單層細(xì)胞。當(dāng)生長時間足夠長時，A549細(xì)胞即將經(jīng)歷細(xì)胞的分化。 A549細(xì)胞可用于病毒研究和相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。另外，由于這些細(xì)胞是合適的轉(zhuǎn)染宿主，因此它們已被用作紫杉醇和貝伐單抗的試驗場所以開發(fā)新的肺癌藥物。

應(yīng)用：

使用CRISPR指導(dǎo)的基因編輯方法創(chuàng)建NRF2基因敲除克隆A549細(xì)胞系

?越來越明顯的是，CRISPR指導(dǎo)的基因編輯將對癌癥和遺傳性疾病的新治療方法的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。隨著對癌癥治療組合方法關(guān)注發(fā)展，建立起了基因編輯技術(shù)，可以敲除靶基因這一事實至關(guān)重要。研究人員利用CRISPR/Cas9通過破壞NRF2核輸出信號（NES）域的功能性來禁用肺癌細(xì)胞A549中的NRF2基因。該蛋白質(zhì)在培養(yǎng)后被大量阻止到轉(zhuǎn)移細(xì)胞核中。并且在細(xì)胞的組織培養(yǎng)中慢慢地產(chǎn)生了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)有基因敲除的A549細(xì)胞具有降低的表型，并且對化學(xué)治療劑（例如順鉑和卡鉑）更敏感。這些觀察結(jié)果在異種移植小鼠模型中得到了證實，即使在沒有藥物治療的情況下，純合的原代的敲除細(xì)胞的增殖速度也比野生型細(xì)胞慢。腫瘤生長被阻止到16天，在接受CRISPR指導(dǎo)的基因編輯和化療聯(lián)合作用的樣品中觀察到腫瘤體積顯著減少。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可在染色體內(nèi)的特定位點識別并執(zhí)行DNA切割，效率出乎意料，并且精度更高。CRISPR/Cas9的天然活性是使細(xì)菌感染的細(xì)胞病毒基因組失活，隨后人類細(xì)胞中CRISPR/Cas9的遺傳功能改造，提供了腺相關(guān)病毒的可能性。研究人員利用CRISPR/Cas9催化的特定基因破壞來提高常用抗癌治療方法的有效性，例如化學(xué)療法或免疫療法。

在這種情況下，研究人員將NRF2基因作為目標(biāo)，因為它是細(xì)胞排毒以及對氧化和親電子應(yīng)激反應(yīng)的中央調(diào)節(jié)器。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入壓力環(huán)境（例如遇到有毒物質(zhì)）時，NRF2的表達(dá)增加。因此，通過破壞NRF2，該結(jié)果表明了化學(xué)治療劑，例如順鉑和卡鉑，將更有效地工作并且劑量更低。從廣義上講，這種方法最終將導(dǎo)致產(chǎn)生相同的殺腫瘤活性所需的化學(xué)療法水平降低，從而改善癌癥患者的生活質(zhì)量。公認(rèn)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在KEAP1的Kelch結(jié)構(gòu)域中具有了一個突變，導(dǎo)致NRF2的過度表達(dá)，它經(jīng)常被用作發(fā)現(xiàn)針對癌癥的新型治療藥物的金標(biāo)準(zhǔn)。

使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯敲除GluIIβ可通過抑制受體酪氨酸激酶活性來抑制A549細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移潛力。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對GLUL基因組位點進(jìn)行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促進(jìn)紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計。

?方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。