抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）是一類通過特定的連接子將靶向單克隆抗體與高殺傷性的細胞毒性小分子藥物偶聯(lián)起來的生物藥，以單克隆抗體為載體將小分子細胞毒性藥物高效地運輸至目標腫瘤細胞中，起到治療的目的。

ADC藥物的結(jié)構(gòu)和特點

（Lancet Oncol. 2016 Jun; 17(6): e254–e262.）

近年來，隨著新的連接子、小分子毒素、抗體以及靶點發(fā)現(xiàn)技術(shù)的不斷更新，ADC藥物也發(fā)展迅速，僅2019年一年，F(xiàn)DA就批準了三款ADC藥物，榮昌生物的國產(chǎn)ADC維迪西妥單抗也在2021年6月獲NMPA批準上市。目前，?全球有100多項ADC藥物相關(guān)的臨床試驗正在進行。

小分子毒素抗體比DAR（drug-to-antibody ratio）是ADC藥物獨特的重要質(zhì)量屬性，它代表抗體偶聯(lián)小分子毒性藥物的平均數(shù)量，較低的DAR會降低ADC的效力，但過高的DAR又會影響ADC分析的藥代動力學和毒性，普遍認為DAR在2-4之間是ADC藥物的最優(yōu)選。而偶聯(lián)方式是影響DAR的重要因素，只有選擇合適的偶聯(lián)技術(shù)，才能讓ADC的毒素均一穩(wěn)定地連接在抗體上。

目前主要有三種偶聯(lián)方式：1) 通過暴露在抗體表面的賴氨酸,?2) 還原鏈間二硫鍵的半胱氨酸,?3) 定點偶聯(lián)技術(shù)來進行偶聯(lián)。其中賴氨酸偶聯(lián)的位點較多，每個抗體上可以掛0~8個小分子毒素，導致每一批次的ADC產(chǎn)品異質(zhì)性較大。而半胱氨酸偶聯(lián)，由于二硫鍵的位置是固定的，所以偶聯(lián)位置也相對可控，但是其鏈接小分子毒素的個數(shù)取決于二硫鍵的還原程度。當4條鏈間二硫鍵均被完全還原時，能攜帶8個毒素；當它被部分還原時，則可能生成DAR為2、4、6、8的產(chǎn)物，半胱氨酸偶聯(lián)產(chǎn)物較賴氨酸，其均一性已經(jīng)顯著提高。定點偶聯(lián)主要是使用生物技術(shù)人為地在單抗上引入鏈接位點。隨著ADC偶聯(lián)方式的進步，ADC藥物抗體比不均的問題也被逐步改善。

半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物DAR分布（光譜網(wǎng)）

藥物偶聯(lián)的程度會影響ADC藥物的穩(wěn)定性和聚集傾向，所以，DAR值是進行ADC藥物分析的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，是ADC藥物研發(fā)過程重要的質(zhì)控環(huán)節(jié)。色譜和質(zhì)譜是檢測DAR值的兩種常用方法。丹納赫生命科學旗下艾杰爾-飛諾美bioZen系列色譜柱，可以出色地完成ADC藥物的分離表征。

艾杰爾-飛諾美色譜柱

對曲妥珠單抗mc-MMAF半胱氨酸偶聯(lián)物的液相色譜檢測

色譜柱：bioZen Intact XB-C8, 3.6 μm

規(guī)格：150 x 2.1 mm

流動相A：0.1 % TFA 水溶液

流動相B：01 % TFA in ACN

流速：0.4mL/min

梯度：28-34 %B in 1-4 minutes ；

? ? ? ? ? 34-65% B in 4-10 minutes

檢測器：LC-UV（280nm）

溫度：80℃

樣品：曲妥單抗mcMMAF半胱氨酸偶聯(lián)物來源于ADC Biotechnology LTD

以上圖譜通過裸抗（黑色峰圖）及鏈接小分子抗體（藍色峰圖）的對比分析，推斷輕、重鏈上鏈接小分子的個數(shù)，再根據(jù)峰面積計算DAR值。該條件使用的bioZen 3.6 μm XB-C8 色譜柱，采用核殼技術(shù)，改善了蛋白的回收率，并且能夠耐受90度的高溫，維持結(jié)果穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的不銹鋼硬件相比，艾杰爾-飛諾美的bioZen系列色譜柱在殼上鏈接了丁基固定相，可大幅減少次級相互作用、殘留和其他回收問題，并降低預平衡時間，避免干擾蛋白質(zhì)或肽的完整性。

艾杰爾-飛諾美 bioZen3.6 μm XB-C8 柱子結(jié)構(gòu)及特點

艾杰爾-飛諾美Biozen色譜柱

對曲妥珠單抗不同偶聯(lián)小分子毒素的HPLC表征

采用丹納赫生命科學旗下SCIEX的高分辨質(zhì)譜，還可以根據(jù)ADC藥物的分子量對DAR值進行分析。對于賴氨酸偶聯(lián)的ADC藥物，采用反向色譜法進行分離，進入質(zhì)譜得到抗體的多電荷信號后，結(jié)合軟件去卷積對分子量進行分析，從而鑒定鏈接小分子的個數(shù)。

SCIEX 高分辨質(zhì)譜ZenoTOF? 7600系統(tǒng)

賴氨酸偶聯(lián)的ADC藥物質(zhì)譜檢測圖譜

SCIEX 高分辨質(zhì)譜ZenoTOF? 7600系統(tǒng)可以精確地檢測ADC的分子量，軟件分析顯示實際檢測的分子量數(shù)值與理論數(shù)值平均誤差小于2 Da。采用BiopharmaView軟件根據(jù)鏈接小分子圖譜的峰面積及載藥負荷能夠方便快捷地計算ADC藥物的DAR值。

BiopharmaView 軟件對ADC的分子量進行計算

同時，對于半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物，可以采用非變性的模式進行分子量的檢測，從而分析DAR值。

半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物質(zhì)譜檢測圖譜

對于ADC藥物的開發(fā)而言，如何依據(jù)藥物的偶聯(lián)方式及目標屬性去選擇合適的質(zhì)量控制方法、質(zhì)量控制項目與性質(zhì)合適的耗材，是助力藥物從理論設(shè)計走向?qū)嶒炇抑苽涞闹匾h(huán)節(jié)。丹納赫生命科學提供的兩種ADC藥物DAR值分析方法，不僅能給用戶提供不同的選擇，還能幫助用戶進行不同方法的相互驗證，確保結(jié)果的準確性。