器官發(fā)育過(guò)程中，及時(shí)調(diào)節(jié)組織成熟對(duì)于平衡生長(zhǎng)與分化細(xì)胞類型的出現(xiàn)和組織功能的獲得至關(guān)重要。發(fā)育中的腸管最初從假?gòu)?fù)層上皮轉(zhuǎn)變?yōu)橛沙跫?jí)絨毛和絨毛間結(jié)構(gòu)域組成的簡(jiǎn)單上皮。絨毛間結(jié)構(gòu)域隨后引起上皮內(nèi)陷，隨后形成成年隱窩，即成年腸道干細(xì)胞的小窩。這些形態(tài)重排控制著成年腸道干細(xì)胞的出現(xiàn)，作為等能的胎兒祖細(xì)胞受到來(lái)自新興干細(xì)胞生態(tài)位的指導(dǎo)性提示。盡管許多研究已經(jīng)涉及腸道發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)事件和成年腸道干細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)，但對(duì)從胎兒細(xì)胞狀態(tài)過(guò)渡到成年細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)知之甚少。因此作者采用CRISPR-Cas9技術(shù)和定制設(shè)計(jì)的小引導(dǎo)RNA（sgRNA）文庫(kù)靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的功能域，以此識(shí)別組織成熟的調(diào)節(jié)因子，進(jìn)一步證明了類器官技術(shù)的新應(yīng)用。

2023年7月，由Stine L. Hansen為第一作者在《SCIENCE ADVANCES》雜志發(fā)表題為《An organoid-based CRISPR-Cas9 screen for regulators of intestinal epithelial maturation and cell fate》的文章，該文章首次利用CRISPR-Cas9技術(shù)篩選出基因Smarca4和Smarcc1。確定了編碼SWI/SNF復(fù)合物成分的基因Smarca4和Smarcc1是上皮成熟的障礙。SMARCC1作為一種與SMARCA4協(xié)同作用的新因子的鑒定突出了SWI/SNF復(fù)合物在維持腸祖細(xì)胞狀態(tài)中的作用。這種保護(hù)作用通過(guò)使細(xì)胞命運(yùn)決定向自我更新分裂傾斜，從而支持胎兒發(fā)育過(guò)程中上皮的持續(xù)生長(zhǎng)。

首先，作者采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)測(cè)定胎兒和成人小腸上皮的類器官培養(yǎng)物的細(xì)胞組成。結(jié)果表明，體內(nèi)腸上皮中存在的所有主要細(xì)胞類型都可以在aOrgs中鑒定。在胎兒腸球（FEnS）中鑒定了兩個(gè)細(xì)胞群，它們與祖細(xì)胞具有不同的轉(zhuǎn)錄譜，與成年分泌譜系聚集在一起。這些細(xì)胞分別與成年上皮中的杯狀細(xì)胞和簇狀細(xì)胞具有顯著的轉(zhuǎn)錄相似性，并且被稱為成人樣胎兒簇I和II。FEnS中存在少量成體樣分泌細(xì)胞，并且培養(yǎng)物沒有自發(fā)轉(zhuǎn)化為aOrgs，這表明轉(zhuǎn)錄或表觀遺傳學(xué)障礙阻止了向成熟成體狀態(tài)的完全轉(zhuǎn)變。因此，推斷功能性CRISPR-Cas9篩選可以識(shí)別轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子構(gòu)成了從胎兒狀態(tài)向成人狀態(tài)過(guò)渡的屏障。為了鑒定區(qū)分FEnS和aOrgs的細(xì)胞表面標(biāo)記物，作為其成熟狀態(tài)的功能讀數(shù)，作者利用了scRNA-seq數(shù)據(jù)集。結(jié)果顯示：過(guò)濾細(xì)胞表面相關(guān)基因的DEGs列表將Ly6a（SCA1）和Kit（cKIT/CD117）鑒定為胎兒祖細(xì)胞和分泌細(xì)胞的標(biāo)記。SCA1先前已被描述為胎兒腸道狀態(tài)的標(biāo)志物和在組織損傷期間經(jīng)歷短暫胎兒樣重編程的成人腸道細(xì)胞的標(biāo)志物。類似地，CD117是成人小腸和結(jié)腸中分泌細(xì)胞的眾所周知的標(biāo)志物。對(duì)兩種標(biāo)記物表達(dá)的分析進(jìn)一步支持了這些觀察結(jié)果，并證明了SCA1在FEnS中的特異性表達(dá)。CD117和SCA1的組合因此在aOrgs和FEnS之間提供了與它們的成熟狀態(tài)一致的高辨別能力（圖1）。

為了進(jìn)行CRISPR-Cas9的篩選，作者在FEnS中表達(dá)組成型活性Cas9，并用sgRNA文庫(kù)在多重感染（MOI）=0.3和每個(gè)sgRNA>400倍的覆蓋率下轉(zhuǎn)導(dǎo)這些。在時(shí)間點(diǎn)T=0收集sgRNA庫(kù)的基線參考樣品。隨后將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞傳代三次，在每次傳代時(shí)，對(duì)2/3的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分選，以分離SCA11HighCD117Neg胎兒祖細(xì)胞、SCA1LowCD117Pos分泌細(xì)胞和SCA1LowCD117Neg細(xì)胞，這些細(xì)胞被認(rèn)為從胎兒狀態(tài)向成人樣狀態(tài)過(guò)渡。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，我們鑒定了SCA1LowCD117Pos分泌細(xì)胞和SCA1LowCD117Neg細(xì)胞的過(guò)渡細(xì)胞。對(duì)來(lái)自每個(gè)分離的細(xì)胞群的DNA進(jìn)行靶向測(cè)序，以量化相對(duì)于參考T=0樣本的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上單個(gè)sgRNA的豐度。正如預(yù)期的那樣，靶向與原代細(xì)胞功能相關(guān)的必需基因的sgRNA在T=1時(shí)已經(jīng)迅速耗盡，而擾亂的對(duì)照sgRNA在三個(gè)傳代過(guò)程中保持穩(wěn)定（圖2）。

為了對(duì)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的單個(gè)基因破壞的影響進(jìn)行有力而嚴(yán)格的分析，我們利用我們的每個(gè)基因多sgRNA方法的力量來(lái)量化針對(duì)同一基因的單個(gè)sgRNA的聯(lián)合效應(yīng)。結(jié)果表明：SCA1表達(dá)的喪失和產(chǎn)生CD117Pos細(xì)胞的能力的增加，Smarca4或Smarcc1受損的胎兒祖細(xì)胞失去了其胎兒特征并獲得了成人樣表型。這表明SMARCA4和SMARCC1可以通過(guò)充當(dāng)成熟的表觀遺傳學(xué)屏障，在保護(hù)胎兒祖細(xì)胞狀態(tài)方面發(fā)揮作用（圖3）。

作者通過(guò)研究Smarca4mut和Smarcc1mut品系與加擾對(duì)照相比是否具有增強(qiáng)的成熟能力。將類器官移植到成年小鼠的結(jié)腸上皮中已被用于確定胎兒和成年腸道中類器官的分化潛力，通過(guò)成人小腸和結(jié)腸的類器官進(jìn)行的移植實(shí)驗(yàn)以及對(duì)移植材料進(jìn)行染色，結(jié)果顯示SMARCA4和SMARCC1對(duì)保護(hù)胎兒狀態(tài)很重要，并且SMARCA4或SMARCC1通常會(huì)在胎兒細(xì)胞成熟過(guò)程中形成表觀遺傳學(xué)屏障（圖4）。

為了了解通過(guò)破壞Smarca4和Smarcc1而產(chǎn)生的細(xì)胞狀態(tài)的分子特征，作者對(duì)突變系和擾亂的對(duì)照進(jìn)行了大量RNA-seq。發(fā)現(xiàn)Smarca4或Smarcc1破壞后下調(diào)的基因主要在FEnS中表達(dá)。相反，Smarca4和Smarcc1破壞后上調(diào)的基因在分泌細(xì)胞、腸細(xì)胞和干細(xì)胞譜系的成體細(xì)胞中表達(dá)。這進(jìn)一步支持了SMARCA4和SMARCC1在維持胎兒未成熟細(xì)胞成熟的表觀遺傳學(xué)屏障方面的功能。

為了了解Smarca4或Smarcc1如何促進(jìn)成人樣成熟，作者使用與胎兒和成人狀態(tài)相關(guān)的許多轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行了基因集富集分析（GSEA）。結(jié)果表明，Smarca4mut和Smarcc1mut系表現(xiàn)出與其胎兒樣起源不同的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)特征，向成人樣狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這與YAP1依賴性轉(zhuǎn)錄程序的活性降低和產(chǎn)生簇狀細(xì)胞的傾向增強(qiáng)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了SMARCA4和SMARCC1在保護(hù)胎兒狀態(tài)中的作用。Smarca4mut和Smarcc1mut系表現(xiàn)出與其胎兒樣起源不同的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)特征，向成人樣狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這與YAP1依賴性轉(zhuǎn)錄程序的活性降低和產(chǎn)生簇狀細(xì)胞的傾向增強(qiáng)有關(guān)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了SMARCA4和SMARCC1在保護(hù)胎兒狀態(tài)中的作用（圖5）。

為了解決在單細(xì)胞水平上突變Smarca4和Smarcc1后在體外產(chǎn)生的成體樣細(xì)胞類型，作者對(duì)擾亂的對(duì)照、Smarca4mut和Smarcc1mut以及aOrgs進(jìn)行了scRNA-seq。與擾亂對(duì)照相比，觀察到整個(gè)胎兒轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)的表達(dá)顯著降低。分析轉(zhuǎn)錄相似性進(jìn)一步表明，衍生自突變系的簇狀細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上與成體細(xì)胞相似，表明這些細(xì)胞已轉(zhuǎn)變?yōu)槌审w樣狀態(tài)?？傊?，這些結(jié)果表明，Smarca4和/或Smarcc1的突變使胎兒腸道祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)失去了其固有的未成熟特性，促進(jìn)了分化為具有簇狀細(xì)胞特性的成人樣狀態(tài)的細(xì)胞比例的增加（圖6）。

作者已經(jīng)成功地在腸道類器官中實(shí)現(xiàn)了CRISPR-Cas9篩選，靶向來(lái)自不同組織成熟階段的上皮培養(yǎng)物中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因子。這是第一個(gè)使用未成熟胎兒樣類器官進(jìn)行體外CRISPR-Cas9篩選的例子，以揭示組織成熟的調(diào)節(jié)因子，突出了類器官技術(shù)的多功能性。通過(guò)對(duì)胎兒和aOrgs的單細(xì)胞分析，觀察到在穩(wěn)態(tài)條件下，少數(shù)胎兒細(xì)胞向分泌譜系的成體樣細(xì)胞過(guò)渡。確定了編碼SWI/SNF復(fù)合物成分的基因Smarca4和Smarcc1是上皮成熟的障礙，因?yàn)檫@些基因在體外的破壞促進(jìn)了胎兒樣標(biāo)記物的丟失和分泌前體和簇狀細(xì)胞標(biāo)記物的獲得，以及類似aOrgs的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳狀態(tài)的采用。體內(nèi)移植研究進(jìn)一步表明，與混亂的對(duì)照系相比，Smarca4mut和Smarcc1mut系具有更強(qiáng)的小腸特性。正如先前的遺傳學(xué)研究報(bào)道的那樣，Smarca4參與腸道成熟，作者的篩選成功地建立在這些觀察結(jié)果的基礎(chǔ)上，并報(bào)道了Smarca在保護(hù)細(xì)胞身份方面尚未被重視的作用。SMARCC1作為一種與SMARCA4協(xié)同作用的新因子的鑒定突出了SWI/SNF復(fù)合物在維持腸祖細(xì)胞狀態(tài)中的作用。這種保護(hù)作用通過(guò)使細(xì)胞命運(yùn)決定向自我更新分裂傾斜，從而支持胎兒發(fā)育過(guò)程中上皮的持續(xù)生長(zhǎng)。