摘要

?蛋白質熱位移?（PTS）分析是一種優(yōu)秀的高通量篩選方法，它使研究人員能夠快速監(jiān)測蛋白質的熱穩(wěn)定性，并確定有利于蛋白質穩(wěn)定性的最佳條件，包括蛋白質-配體相互作用和蛋白質序列突變的研究。蛋白質熱位移是基于溫度誘導的蛋白質變性，使用應用生物系統(tǒng)公司的蛋白質熱位移?染料進行監(jiān)測。這種檢測方法不需要任何關于蛋白質功能或配體活性的先驗知識。應用生物系統(tǒng)公司的實時PCR系統(tǒng)繪制整個熱熔體中的熒光數(shù)據(jù)，在測試緩沖環(huán)境中或在測試配體存在的情況下生成感興趣蛋白質的熒光譜。因此，我們開發(fā)了蛋白質熱位移?軟件v1.0，該軟件利用玻爾茲曼方程從熒光熔體圖中計算出蛋白質的Tm。然后，可以比較使用一系列緩沖條件、添加不同配體或改變蛋白質折疊和穩(wěn)定性的蛋白質序列突變所獲得的Tm值。在這項研究中，我們演示了這個分析的效用緩沖和配體篩選T4 DNA連接酶，其Tm轉移ATP的存在，使蛋白質熱轉移?分析一個重要的新篩選工具?射線晶體學家尋找條件，促進他們感興趣的蛋白質的穩(wěn)定性。此外，我們還證明了該PTS檢測在區(qū)分M-MLV、上標?II和上標?III逆轉錄酶的點突變變異方面的實用性。最后，我們證明了該PTS可以有效地檢測抗體與目標蛋白的結合。

介紹

?分離或獲取感興趣的蛋白質往往涉及到困難和費用，需要注意后續(xù)處理或存儲，以最大限度地提高蛋白質的效用和壽命，并確保數(shù)據(jù)質量不受降解或聚合事件的影響。有利于長期穩(wěn)定性的條件是幾乎所有涉及蛋白質的研究或應用技術的共同要求。有許多因素可能影響蛋白質的穩(wěn)定性，包括鹽濃度、pH或使用特定的配體，可以以不同的方式與蛋白質相互作用。考慮到人們可以測試大量可能的組合，以確定有利于最大穩(wěn)定性的環(huán)境條件，因此非常希望采用一種能夠簡化和簡化調查過程的技術。AB?實時PCR系統(tǒng)上的PTS檢測是一種快速、方便的檢測蛋白質熱穩(wěn)定性變化的篩選方法。

材料和方法

應用生物系統(tǒng)公司的蛋白質熱轉移?染料的使用減輕了任何對蛋白質功能或配體活性的先驗知識的要求。在天然蛋白質的存在的情況下，染料被自然猝滅。當感興趣的蛋白質隨著溫度的升高而開始變性時，蛋白質的疏水核心就會暴露出來。染料會對環(huán)境中的這種變化做出反應，并開始發(fā)出熒光

圖1。PTS染料的預測作用示意圖。自然淬滅的染料只有在暴露在變性蛋白質的疏水區(qū)域時才會發(fā)出熒光。

結果

應用程序的蛋白質熱輪班? :篩選蛋白質穩(wěn)定性的優(yōu)化緩沖條件篩選能夠結合和增強蛋白質穩(wěn)定性的配體通過點突變進行篩選以增強穩(wěn)定性篩選能提高蛋白質結晶穩(wěn)定性的條件。

圖2。在Viia上生成的熔化曲線數(shù)據(jù) 7實時PCR系統(tǒng)顯示特異性配體（ATP）對蛋白質穩(wěn)定性（T4DNA連接酶）的影響。T曲線的增加超過7oC在有配m體存在的情況下。圖2描述了一種特定的蛋白質配體TSA的四次重復反應。左圖為熔體曲線，右圖為熔體曲線的導數(shù)。紅色曲線代表T4 DNA連接酶沒有配體時，藍色曲線代表ATP存在時的T4 DNA連接酶，綠色曲線為對照。T4 DNA連接酶的Tm約為41℃當ATP加入到反應中時，它會發(fā)生偏移，導致偏移約為7oC更高。這種轉變清楚地證明了添加ATP所增加的穩(wěn)定性。

應用生物系統(tǒng)的蛋白質熱Shift?軟件 v1.0提供通過玻爾茲曼曲線擬合和導數(shù)峰計算的蛋白質Tm針對參考曲線的增量Tm值(s)打印、表格和導出結果多板分析與重復統(tǒng)計數(shù)據(jù)快速Delta Tm可視化

緩沖區(qū)試驗面板(A1-D4):

A（100 mM檸檬酸鈉，pH 5.5,0-150 mM氯化鈉）

B (100 mM磷酸鉀，pH值6.0,0150 mM氯化鈉）

C (100 mM磷酸鉀，pH值7.0,0150 mM氯化鈉）

D（100 mM Hepes，pH 7.5,0-150 mM氯化鈉）

圖4。通過在7500快速實時熒光定量PCR儀上進行的

PTS實驗，研究了鹽濃度和pH對T4 DNA連接酶穩(wěn)定性的影響的衍生熔融曲線（非專家模式）。整個圖中的

Tm差異范圍為39.5 C（A3）至45 C（C4），證明了緩沖條件對蛋白質熱穩(wěn)定性的影響。在儲存或處理緩沖液中的鹽與蛋白質的帶電氨基酸相互作用，最終影響所產生的蛋白質三級結構的穩(wěn)定性。

圖5。PTS分析可以區(qū)分影響蛋白質熱穩(wěn)定性的蛋白質中的點突變。PTS在ViiA上生成的數(shù)據(jù)TM7儀器顯示了來自實驗MMLV、上標?II和上標?III（上）的熒光和衍生物熔體譜，以及每個酶通過與配體孵育而熱移（下）

圖6。單克隆抗體（抗人裝飾蛋白）與人裝飾蛋白結合得到的PTS含量小于10 C，證明了抗體能有效地檢測到抗體與該蛋白的結合。本PTS實驗在7500快速實時PCR儀上（非專家模式）上進行。

結論

蛋白質熱轉移?是一種快速、廉價和直接的工具，用于篩選最合適的條件，最大限度地提高蛋白質的穩(wěn)定性。AB實時PCR儀器的使用提供了一系列的好處，以幫助蛋白質熱位移?測試工作流程。此外，操作軟件的靈活性允許在任何期望的斜坡速度下在廣泛的溫度范圍內收集熒光數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)很容易在系統(tǒng)軟件中查看，或導出以供離線進一步分析。這些數(shù)據(jù)來自應用生物系統(tǒng)的實時PCR系統(tǒng)，包括7500,7500快速，StepOneTM，StepOnePlus和tmViia 7個實時PCR儀器，展示了這些系統(tǒng)的多功能性。使用AB實時PCR系統(tǒng)和蛋白質熱移進行蛋白質熱移分析的tm好處軟件v1.0包括自動生成的湯姆，增加運行方法程序的靈活性和用戶的能力重置溫度范圍在更復雜的融化的情況下，在小反應體積，提供快速和準確的結果只有幾μg的蛋白質。

參考文獻

1.Neisen等。al.-2007年9月13日在線發(fā)布；doi：10。

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僅供研究使用。不打算用于任何動物或人類的治療或診斷用途。