寫在前面

????????今天推薦的是由美國德克薩斯大學MD Anderson癌癥中心在2019年2月7日發(fā)表于Nature Communications（2020IF：14.919，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Min Sup Song教授，研究表明PTEN通過USP11經(jīng)PI3KFOXO途徑進行自我調(diào)節(jié)，穩(wěn)定腫瘤抑制作用。

研究背景

????????PTEN是一種脂質(zhì)磷酸酶，可拮抗PI3K/AKT通路，被認為是主要的劑量依賴性腫瘤抑制因子。因此，控制PTEN水平的細胞機制提供了潛在的癌癥治療途徑，但這些機制尚不明確。

摘要部分

????????在這里，作者證明PTEN通過PI3K/FOXO 途徑對去泛素化酶USP11的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，在調(diào)節(jié)其自身穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要的作用，并進一步表明這種前饋機制與其抑制腫瘤作用有關(guān)，因為缺乏Usp11的小鼠顯示出對PTEN依賴的腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移的敏感性增加。USP11在癌癥患者中被下調(diào)，并且與PTEN表達和FOXO核定位相關(guān)。因此，作者的研究結(jié)果表明PTEN-PI3K-FOXO-USP11構(gòu)成了調(diào)節(jié)前饋回路，可提高PTEN的穩(wěn)定性和腫瘤抑制活性。

研究內(nèi)容

1.USP11通過上調(diào)PTEN來拮抗PI3K活性??? ?

????????為了鑒定調(diào)節(jié)PI3K/AKT途徑的DUB，通過系統(tǒng)篩選，作者基于PTEN蛋白積累將USP11鑒定為PI3K/AKT途徑的有效抑制劑。然后通過相互免疫沉淀來確定內(nèi)源性USP11和PTEN之間的結(jié)合。值得注意的是，野生型 (WT)USP11在體內(nèi)和體外使PTEN去泛素化，而催化失活的USP11C318S (CS) 突變體仍然可以與PTEN結(jié)合，但其去泛素化PTEN的能力顯著減弱。WT USP11的過表達也增加了PTEN水平。

????????為了進一步確定USP11是否可以調(diào)節(jié)PTEN蛋白的穩(wěn)定性，作者接下來研究了在放線菌酮（CHX）（一種蛋白質(zhì)合成抑制劑）存在下的內(nèi)源性PTEN蛋白水平。重要的是，在USP11下調(diào)后，NB4人APL細胞中內(nèi)源性PTEN蛋白的穩(wěn)定性顯著降低。作者之前已經(jīng)證明，HAUSP專門去除了PTEN的單泛素化以用于其核輸出。因此，作者測試了USP11是否可以去除細胞核中PTEN的單泛素化。雖然HAUSP去除了PTEN的單泛素化，但USP11沒有去除PTEN的單泛素化，這表明USP11代表了一種獨特的DUB，可以在細胞核中去多聚泛素化并穩(wěn)定PTEN。為了進一步測試USP11通過PTEN拮抗PI3K活性，作者通過PTEN+/+?和PTEN-/-MEF中的 RNA 干擾敲低了USP11。胰島素刺激導致急性AKT磷酸化，以及Usp11敲低的細胞中PIP3的增加，其水平高于在Pten+/+對照細胞中觀察到的水平，這意味著USP11具有PTEN依賴的PI3K抑制功能。在刺激血清、IGF-1或EGF時觀察到類似的結(jié)果。

研究結(jié)論：USP11可以逆轉(zhuǎn)PTEN的多泛素化，穩(wěn)定PTEN蛋白，從而抑制PI3K/AKT通路的激活。

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2.Usp11的丟失誘發(fā)了細胞的生長、運動和代謝??? ?

????????作者隨后探究USP11在體內(nèi)的生物學功能?；虬邢蚝邪旅顾乜剐曰?(neoR) lacZ，并已整合到USP11的外顯子中以產(chǎn)生USP11-的功能失調(diào)等位基因。由于USP11是 X 連鎖基因，雜合子雄性（Usp11-/Y）胚胎足以產(chǎn)生USP11功能缺失突變。與WT相比，從USP11-/Y胚胎分離的原代MEF中，內(nèi)源性PTEN蛋白（但不是 mRNA）的水平降低，AKT及其下游靶標的磷酸化率增強。

????????鑒于PTEN的腫瘤抑制作用，作者推測USP11的缺失可能會促進多個致瘤過程。事實上，原代USP11-/YMEF顯示出比它們的 WT 對應物更高的增長率。腺病毒E1a與活化的Ha-ras、SV40 large T抗原（T-Ag）或 p16INK4a和p19Arf?shRNA 組合的轉(zhuǎn)化效率，在USP11缺陷細胞中的轉(zhuǎn)化效率也顯著高于WT培養(yǎng)物。用這些轉(zhuǎn)化細胞在體內(nèi)產(chǎn)生小鼠同種異體移植物，證實了USP11的關(guān)鍵腫瘤抑制功能。當USP11-/YMEF進行傷口愈合試驗時，發(fā)現(xiàn)USP11-/YMEF比 WT 細胞更快地閉合傷口。還注意到，USP11缺失后細胞運動性的增加伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶的上調(diào)。此外，與 WT 對應物相比，USP11缺陷細胞顯示出更高的葡萄糖攝取率、乳酸產(chǎn)生率和谷氨酰胺消耗率。相比之下，過表達USP11的細胞表現(xiàn)出葡萄糖和谷氨酰胺代謝受損，伴隨著質(zhì)膜組分中 GLUT1（1 型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白）的表達降低。

研究結(jié)論：USP11的缺失會增加細胞增殖、運動和代謝。

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3.Usp11基因敲除會增強TRAMP小鼠的腫瘤進展? ? ?

????????USP11- 小鼠（Usp11-/Y?和USP11-/-）是能夠存活的并且以預期的孟德爾比率出生。由于PTEN水平降低與小鼠前列腺腫瘤的發(fā)生和進展增加相關(guān)，作者評估了USP11在體內(nèi)前列腺腫瘤發(fā)生中的作用。值得注意的是，11周齡的USP11-/Y小鼠表現(xiàn)出顯著增大的前列腺葉和增加的前列腺上皮細胞增殖。作者將USP11-/Y小鼠與TRAMP（轉(zhuǎn)基因腺癌小鼠前列腺）小鼠雜交，以驅(qū)動 SV40 T 抗原 (Ag)34 的前列腺特異性表達。使用SV40 T Ag的臨床意義在于它通過結(jié)合和滅活Trp53和Rb1腫瘤抑制基因來誘導致癌性進展。

????????為了研究USP11敲低對前列腺的早期影響，在10周齡時處死了不同USP11背景的TRAMP小鼠，并進行了組織病理學分析。USP11-/Y小鼠的高級前列腺上皮內(nèi)瘤變（HG-PIN）發(fā)生率顯著高于年齡匹配的TRAMP；Usp11+/Y小鼠。磁共振成像MRI MRI分析顯示，與年齡匹配的TRAMP;Usp11+/Y隊列相比，20周大的TRAMP;Usp11-/Y小鼠的前列腺中存在更大的腫瘤腫塊。通過蘇木精和伊紅染色的組織學觀察發(fā)現(xiàn)，TRAMP;Usp11-/Y小鼠有嚴重的惡性進展，而年齡匹配的TRAMP;Usp11+/Y小鼠的前列腺則保存下來，組織呈現(xiàn)出PIN表型。值得注意的是，與TRAMP對照小鼠相比，TRAMP;Usp11-/Y小鼠表現(xiàn)出較低的PTEN表達水平和較高的AKT磷酸化水平。SMA染色顯示，與年齡匹配的TRAMP; Usp11+/Y小鼠相比，TRAMP;Usp11-/Y小鼠有高度滲透性的浸潤性前列腺腺癌。此外，多個腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移到 TRAMP;Usp11-/Y小鼠的淋巴結(jié)比在 TRAMP;Usp11+/Y?小鼠中的發(fā)生率要低得多。

研究結(jié)論：USP11作為前列腺癌發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移的潛在X連鎖腫瘤抑制因子。

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4.USP11介導的腫瘤抑制作用依賴于PTEN

????????前列腺癌，ERG基因經(jīng)常易位到 TMPRSS2 啟動子區(qū)域，由于異常 ERG 表達與PTEN單倍體不足共同促進癌癥進展，作者評估了USP11缺失是否會影響ERG依賴性細胞過程。USP11的敲低增強了穩(wěn)定過表達ERG（22Rv1 ERG）的ERG陰性22Rv1人前列腺癌細胞中的生長、侵襲以及葡萄糖和谷氨酰胺代謝。為了進一步研究USP11 DUB活性對USP11介導的腫瘤抑制的貢獻，作者使用了人類單倍體癌細胞系 HAP1，其中USP11的單個等位基因已被 CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除。重新引入 WT，而不是無催化活性的 CS USP11導致癌細胞生長、侵襲以及葡萄糖和谷氨酰胺代謝減少。在USP11敲除MEF中觀察到類似的結(jié)果。接下來，作者測試了USP11是否通過PTEN調(diào)控發(fā)揮腫瘤抑制器的功能。過表達USP11抑制了PTEN回補PTEN失活的人類前列腺癌細胞（PC3 PTENWT）的生長，但沒有抑制表達對照載體的PC3細胞（PC3 PTEN-/-）。USP11的過表達也降低了PC3 PTENWT而非PC3 PTEN-/-細胞的侵襲能力。USP11過表達同樣導致 PC3 PTENWT?細胞中葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生和谷氨酰胺消耗減少，而在 PC3 PTEN-/-?細胞中未觀察到顯著差異。相反，敲低USP11會增強 PC3 PTENWT?細胞而非PC3PTEN-/-?細胞的細胞生長、侵襲和能量代謝，表明USP11發(fā)揮PTEN依賴性腫瘤抑制功能。

研究結(jié)論：USP11介導的腫瘤抑制作用依賴于PTEN。

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5.在人類癌癥中，USP11減少并與PTEN相關(guān)聯(lián)

????????人類前列腺癌的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，USP11轉(zhuǎn)錄物的表達在原發(fā)性前列腺腫瘤中被下調(diào)，其減少與腫瘤的侵略性密切相關(guān)。在人類乳腺腫瘤中也觀察到USP11的下調(diào)46。作者通過從另一個可用的數(shù)據(jù)庫中提取的癌癥患者生存分析，進一步證實了USP11下調(diào)的臨床意義，這表明其抑制可能會影響腫瘤性惡性腫瘤和臨床結(jié)果。為了確定USP11對PTEN調(diào)節(jié)的臨床意義，作者研究了人類前列腺癌和三陰性乳腺癌（TNBC）樣本的腫瘤組織微陣列（TMA）。首先，PTEN DNA狀態(tài)的熒光原位雜交（FISH）分析顯示，在作者的前列腺和TNBC TMAs中，85.3%和83.5%分別有兩個PTEN拷貝。然后，作者研究了這些兩個PTEN基因拷貝病例的TMA中，USP11的表達水平是否與PTEN蛋白水平相關(guān)。值得注意的是，對人類前列腺腫瘤的免疫組化分析表明，USP11和PTEN蛋白水平之間存在統(tǒng)計學意義上的正相關(guān)。同樣，在TNBC樣本中，USP11和PTEN蛋白水平之間也存在高度正相關(guān)。

研究結(jié)論：在相當一部分人類惡性腫瘤中，USP11被下調(diào)，在沒有PTEN基因組丟失的情況下，USP11表達的減少可以作為PTEN失活的一種機制發(fā)揮作用。

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6.USP11介導細胞密度依賴的PTEN調(diào)節(jié)? ? ?

????????正常細胞在達到匯合后通常會停止增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞接觸抑制。然而，致癌基因的激活和抑癌基因的失活可以阻止接觸抑制。因此，作者測試了細胞密度對USP11介導的PTEN調(diào)節(jié)的影響。有趣的是，PTEN表達在以高細胞密度生長的初級和轉(zhuǎn)化MEF中都大大增加。在高細胞密度下觀察到的PTEN升高不是由于PTEN轉(zhuǎn)錄速率的增加，因為PTEN mRNA 保持不變。此外，稀疏細胞中的PTEN蛋白周轉(zhuǎn)率更高，內(nèi)源性PTEN免疫沉淀物在低密度細胞中比在高密度細胞中表現(xiàn)出更重的多泛素化模式。

????????作者接下來測試了細胞密度對USP11介導的PTEN調(diào)節(jié)的影響。令人驚訝的是，USP11的 mRNA 水平在密集細胞中遠高于稀疏細胞。更重要的是，USP11的敲低抑制了高密度誘導的PTEN上調(diào)。

研究結(jié)論：細胞密度通過USP11的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來控制PTEN蛋白的生理水平。

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7.FOXO是USP11的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活劑? ???

????????為了研究USP11如何受細胞密度的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者通過數(shù)據(jù)庫尋找USP11啟動子。在多個候選者中，作者對FOXO特別感興趣，因為已知它是高密度誘導基因激活的關(guān)鍵參與者。在高密度條件下，F(xiàn)oxo1 shRNA 確實損害了USP11的蛋白質(zhì)和mRNA水平的升高，但不損害其他DUB。同樣，F(xiàn)oxo1 敲低顯著降低了USP11啟動子報告基因構(gòu)建體 pUSP11-Luc的熒光素酶活性，而 FOXO1、3 或 4 的過表達強烈促進了USP11的轉(zhuǎn)錄激活。內(nèi)源性 FOXO1 蛋白與包含USP11啟動子內(nèi)關(guān)鍵 FOXO 結(jié)合位點的區(qū)域結(jié)合，高細胞密度顯著增強了FOXO1的結(jié)合，表明FOXO蛋白可以直接激活USP11的轉(zhuǎn)錄。更重要的是，F(xiàn)oxo1 的敲低削弱了原代MEF中高密度誘導的PTEN上調(diào)，表明 FOXO 在PTEN表達的生理調(diào)節(jié)中起重要作用。

????????FOXO 的激活可以通過乙?；刂疲邹继J醇誘導SIRT1介導的 FOXO去乙?；?。因此，作者測試了白藜蘆醇是否通過 SIRT1/FOXO 誘導USP11轉(zhuǎn)錄。白藜蘆醇增加了USP11蛋白和 mRNA 水平，但這種效果因 SIRT1的敲低而減弱。敲低 FOXO1 同樣降低了白藜蘆醇對USP11轉(zhuǎn)錄激活的影響，表明白藜蘆醇至少部分通過 SIRT1/FOXO 途徑促進USP11表達。值得注意的是，白藜蘆醇顯著提高了PTEN水平，主要是通過增加PTEN蛋白的穩(wěn)定性。更重要的是，在USP11敲低的細胞中，白藜蘆醇對PTEN蛋白水平的升高降低，表明白藜蘆醇通過USP11的激活上調(diào)PTEN蛋白表達。作者還發(fā)現(xiàn)缺乏 AKT磷酸化位點的 FOXO 活性核突變體的過表達導致USP11啟動子活性的顯著增加。

研究結(jié)論：FOXO是USP11的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活劑。

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8.PTEN通過信號前饋機制進行自動調(diào)控? ? ?

????????作者首先觀察到，與WT親本（PTEN+/+）或雜合子（PTEN+/-）細胞相比，同源PTEN缺失（PTEN-/-）HCT116結(jié)腸癌細胞中USP11的蛋白質(zhì)和mRNA水平明顯降低，而其他任何已知的PTEN DUBs則不然。熒光素酶報告試驗顯示，PTEN的缺失同樣抑制了USP11啟動子的活性，值得注意的是，在PTEN缺陷的細胞中，F(xiàn)OXO1與USP11啟動子中一個關(guān)鍵的FOXO結(jié)合點的結(jié)合受到影響。與這些體外結(jié)果相一致的是，在Pten基因敲除的小鼠前列腺中，當PIN的發(fā)生率和細胞增殖率較低時，USP11被證明是下調(diào)的，這意味著PTEN在體內(nèi)控制USP11的表達中起著關(guān)鍵作用。

????????接下來，為了闡明PTEN/PI3K/AKT信號通路對USP11調(diào)控的貢獻，作者在PI3K/AKT通路被阻斷時測試了USP11的表達。值得注意的是，BKM120或LY294002對PI3K的抑制顯著增加了USP11蛋白和mRNA水平，伴隨著PTEN的上調(diào)。相反，用有效的PTEN抑制劑 VO-OHpic4處理導致USP11表達降低，伴隨著PTEN的下調(diào)。此外用蛋白酶體抑制劑MG132處理并沒有導致用BKM120抑制PI3K或消減PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85所誘發(fā)的PTEN蛋白水平進一步增加，這表明PTEN調(diào)節(jié)環(huán)是由泛素-蛋白酶體途徑介導的。另一方面，表達PTEN C124S或PTEN G129E磷酸酶無活性的突變體導致USP11的蛋白質(zhì)、mRNA和啟動子活性水平顯著降低?？傊?，這些結(jié)果表明，PTEN-PI3K/AKTFOXO和USP11-PTEN整合成一個PTEN前饋信號網(wǎng)絡。

研究結(jié)論：PTEN通過信號前饋機制進行自動調(diào)控。

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結(jié)論與討論

????????首先，作者發(fā)現(xiàn)X連鎖腫瘤抑制因子USP11是一個重要的生理性DUB，可以拮抗PI3K/AKT信號通路。其次，作者發(fā)現(xiàn)PTEN通過PI3K-FOXO-USP11前饋環(huán)路進行自我調(diào)節(jié)，形成一個誘導腫瘤抑制的PTEN“整合電路”。此外，結(jié)果顯示，這種前饋機制作為一種載體，細胞密度通過它來控制PTEN蛋白的生理劑量，因此, 可能使細胞在高密度介導的細胞增殖抑制過程中誘導PTEN表達。總之，作者報告了一個PTEN前饋機制的鑒定，并定義了它在腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用及其與患者的臨床相關(guān)性。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-08481-x