文獻(xiàn)學(xué)習(xí)-SARS-CoV-2的ACE2受體在視網(wǎng)膜的表達(dá)
摘要
目的
研究人類視網(wǎng)膜中 SARS 冠狀病毒2型受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2蛋白(ACE2)的表達(dá)。
方法
分析13例非糖尿病對(duì)照組和11例糖尿病視網(wǎng)膜病變死后眼睛中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的表達(dá)。為了比較涉及糖尿病的不同器官之間的血管性血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的表達(dá)，我們研究了非糖尿病患者和糖尿病腎病患者腎臟標(biāo)本中ACE2的表達(dá)。TMPRSS2(一種促進(jìn) SARS-CoV-2進(jìn)入的細(xì)胞表面蛋白酶)的表達(dá)也在人類非糖尿病視網(wǎng)膜中進(jìn)行了研究。原代人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(HRECs)和原代人視網(wǎng)膜周細(xì)胞(HRPC)進(jìn)一步用于確認(rèn)人視網(wǎng)膜血管 ACE2的表達(dá)。
結(jié)果
我們發(fā)現(xiàn) ACE2在多個(gè)非血管性視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中均有表達(dá)，包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層和感光外層。引人注目的是，我們?cè)谔悄虿∫暰W(wǎng)膜病變標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了更多的血管。相比之下，在另一個(gè)受糖尿病影響的終末期器官中，腎臟、非糖尿病患者和糖尿病腎病的ACE2顯示出腎小管上皮細(xì)胞的頂端表達(dá)，但腎小球或腎小管周圍毛細(xì)血管沒有內(nèi)皮表達(dá)。來自 HRECs 和 HRPC 的蛋白裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了 ACE2的表達(dá)。TMPRSS2在多種視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞、血管和血管周細(xì)胞以及 Müller 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。
結(jié)論
這些結(jié)果表明視網(wǎng)膜表達(dá) ACE2和 TMPRSS2。此外，糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜中血管 ACe2的表達(dá)增加。
引言
在過去的一年中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2的重要性已經(jīng)通過與病毒穗蛋白的結(jié)合而成為 SARS-CoV-21的關(guān)鍵細(xì)胞表面受體，除了它作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的公認(rèn)作用之外。就其心血管效應(yīng)而言，ACE2已知在多種疾病環(huán)境中具有主要的保護(hù)作用，包括糖尿病心血管并發(fā)癥。實(shí)際上，臨床試驗(yàn)的薈萃分析表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑(如 ACE 抑制劑和糖尿病視網(wǎng)膜病變阻滯劑)可以降低患血管緊張素受體糖尿病視網(wǎng)膜病變的風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的增加對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變有保護(hù)作用。相反，在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的缺乏加劇了糖尿病心血管并發(fā)癥。有趣的是，鑒于其對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要性，人類視網(wǎng)膜(包括視網(wǎng)膜血管細(xì)胞)中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的表達(dá)尚未見報(bào)道。
2019冠狀病毒疾病和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2與糖尿病的相互作用已經(jīng)引起了相當(dāng)多的關(guān)注。已知糖尿病患者具有更不利的臨床結(jié)果，并且先前存在的糖尿病增加了 COVID-19誘導(dǎo)的腎損傷以及細(xì)胞因子風(fēng)暴的風(fēng)險(xiǎn)。10,11其中一個(gè)重要組成部分可能是由 ACE2的組織表達(dá)引起的2019冠狀病毒疾病向性。糖尿病患者的細(xì)支氣管、肺泡和肝臟中 ACE2蛋白的表達(dá)增加。
SARS 冠狀病毒2型的視網(wǎng)膜病變已引起越來越多的關(guān)注。眾所周知，2019冠狀病毒疾病會(huì)引起呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)以外的全身性損傷，從而加深對(duì)這種疾病作為多器官疾病的認(rèn)識(shí)，影響大腦、心臟、腎臟、消化系統(tǒng)以及眼表。最近幾個(gè)月，越來越多的報(bào)告表明，2019冠狀病毒疾病患者的視網(wǎng)膜異常。這些研究記錄了視網(wǎng)膜病變，包括出血和棉花斑點(diǎn)，靜脈擴(kuò)張，血管彎曲和視網(wǎng)膜扇形蒼白。16-19一些研究者報(bào)道了通過 OCT 血管造影評(píng)估的2019冠狀病毒疾病患者視網(wǎng)膜微血管的改變，包括視網(wǎng)膜和中心凹血管密度降低。20-22死后眼組織研究已經(jīng)證實(shí)在一些 COVID-19.23,24病例中有眼內(nèi) SARS-CoV-2的證據(jù)。有文獻(xiàn)報(bào)道了與2019冠狀病毒疾病有關(guān)的嚴(yán)重視力喪失，包括急性視網(wǎng)膜壞死25和急性病毒性視網(wǎng)膜炎，26在玻璃體檢查中證實(shí)了 SARS-CoV-2陽(yáng)性。需要更多地關(guān)注潛在的致病性視網(wǎng)膜損傷和感染。關(guān)于視網(wǎng)膜2019冠狀病毒疾病表現(xiàn)的一個(gè)重要問題是視網(wǎng)膜是否會(huì)被 SARS 冠狀病毒2感染。值得注意的是，在大腦中，SARS-CoV-2受體 ACE2在脈絡(luò)叢27和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，28可能促進(jìn)血腦屏障的感染和損傷。
引人注目的是，人類視網(wǎng)膜是否表達(dá)感染的宿主易感因子，特別是 ACE2和 TMPRSS2，這種細(xì)胞表面相關(guān)蛋白酶在穗蛋白與 ACE2,1,29結(jié)合后促進(jìn)病毒進(jìn)入尚未報(bào)道。此外，糖尿病對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2表達(dá)的影響尚未得到研究，這是一個(gè)重要問題，因?yàn)樘悄虿∫阎獣?huì)加劇2019冠狀病毒疾病的多器官受累。ACE2在糖尿病中的表達(dá)是進(jìn)一步的興趣，因?yàn)?ACE2在 DR 和其他并發(fā)癥的進(jìn)展中可能具有重要意義。因此，在這項(xiàng)研究中，我們使用類似于我們以前的眼表研究的免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了 ACE2和 TMPRSS2蛋白在死后人眼中的表達(dá)。我們還使用培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞研究了特定血管細(xì)胞類型中 ACE2的表達(dá)。
方法
病人和標(biāo)本
我們從13名沒有眼部疾病的非糖尿病對(duì)照者和11名患有約翰·霍普金斯醫(yī)院糖尿病視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者尸體解剖標(biāo)本中收集了死后的人體球體。組織被固定在10% 福爾馬林和石蠟包埋所描述的。30臨床細(xì)節(jié)有關(guān)的研究病人在表中描述。研究方案已獲機(jī)構(gòu)審核委員會(huì)約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院批準(zhǔn)。
免疫組織化學(xué)染色法
簡(jiǎn)而言之，將去石蠟切片在100 × 抗原修復(fù)緩沖液(ab93678，Abcam，劍橋，MA)中煮沸20分鐘。在 PBS 稀釋的5% 正常山羊血清中封閉后，將切片與抗 ACE2抗體(ab108252,1:100; Abcam，Cambridge，MA，USA) ，抗 TMPRSS2抗體(ab92323,1:2000; Abcam)和同種型和濃度匹配的正常 IgG 對(duì)照(ab172730，Abcam)在4 ° C 過夜。將切片與次級(jí)生物素化山羊抗兔 IgG (1:2000)在室溫下溫育一小時(shí)。然后使用堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)(Vectastain ABC-AP kit，Vector lab，伯靈格姆，CA)檢測(cè) ACe2染色，并且通過將切片與堿性磷酸酶底物(Vector blue AP 襯底 kit III; Vector Laboratories，伯靈格姆，CA，USA)孵育20至30分鐘產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物。切片用核固定紅(Vector Laboratories)復(fù)染，用安裝介質(zhì)(H-5501，Vector Laboratories)安裝，并在光學(xué)顯微鏡下檢查。對(duì)于 ACE2陽(yáng)性血管的定量，從視神經(jīng)附近的四個(gè)連續(xù)視野采集放大倍數(shù)為10的圖像。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2陽(yáng)性血管的數(shù)量由兩名獨(dú)立觀察員以不公開的方式量化。
免疫熒光染色
在100 × 抗原修復(fù)緩沖液(ab93678; Abcam)中煮沸20分鐘后，將切片在用1% triton X-100稀釋的 Tris 緩沖鹽水(TBS)中的5% 正常驢血清中封閉。然后將切片與抗 ACE2抗體(AF933,3μg/mL; R & D，Boston，MA，USA)和抗 CD31(ab76533,1:500; Abcam)在4 °C 溫育過夜。用 TBS 徹底洗滌后，將切片與 Alexa 488驢抗兔 IgG (1:400)和 Alexa 594驢抗山羊 IgG (1:400)在室溫下溫育1小時(shí)。DAPI 用于復(fù)染。圖像采取共焦(LSM 880; 蔡司，Oberkochen，德國(guó))。
細(xì)胞培養(yǎng)
將人視網(wǎng)膜周細(xì)胞(HRPs; Cell Systems，Kirkland，WA)在用血清和 CultureBoost (Cell Systems)在正常血糖水平配制的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在第5至7代時(shí)使用。人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(HRECs; Cell Systems)在 EGM2-MV 培養(yǎng)基(Lonza)中培養(yǎng)。HRECs 在纖維連接蛋白(Invitrogen，卡爾斯巴德)包被的培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)，并在第6至10代使用。HRPs 和 HRECs 在37 °C 的加濕的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每?jī)傻饺旄鼡Q一次。
結(jié)果
ACE2在人視網(wǎng)膜中的表達(dá)
我們首先檢測(cè) ACE2在缺乏眼部異常的非糖尿病對(duì)照視網(wǎng)膜中的表達(dá)。在所有標(biāo)本中，我們發(fā)現(xiàn) ACE2在多個(gè)非血管性視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層和感光細(xì)胞外段(圖1A)。內(nèi)核層的染色在內(nèi)外條紋，包括相鄰的突觸中尤為突出(圖1A)。同種型 IgG 對(duì)照染色陰性(圖1B)。
ACE2 expression in human retina. (A) Characteristic ACE2 expression in retina specimens from nondiabetic retina. ACE2 expression was found in some cells in the retinal ganglion cell layer, inner plexiform layer, and inner nuclear layer. (B) Isotype IgG control was negative for staining.
ACE2在糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜中的表達(dá)增加
我們進(jìn)一步研究了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2在糖尿病視網(wǎng)膜病變標(biāo)本中的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(nPDR)和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的神經(jīng)視網(wǎng)膜 ACE2表達(dá)與非糖尿病對(duì)照標(biāo)本相似(圖2A)。引人注目的是，與非糖尿病患者相比，在 NPDR 和 PDR 標(biāo)本的視網(wǎng)膜血管中，在淺層和深層神經(jīng)叢中，ACE2染色顯著。我們量化了鄰近視神經(jīng)的四個(gè)連續(xù)10 × 視野中 ACE2陽(yáng)性血管的數(shù)量，并且與非糖尿病相比，在 NPDR 和 PDR 標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)顯著更多的 ACE2陽(yáng)性血管(圖2B)。在5例 PDR 患者中，只有2例顯示與之前激光治療相一致的顯微病變。其中一例與其他病例相比，ACE2 + 染色較少。然而，基于有限的病例數(shù)，我們無法得出激光光凝是否可能改變 ACE2表達(dá)的結(jié)論。同種型 IgG 對(duì)照染色陰性(圖2D)。
Increased vascular ACE2 expression in diabetic retinopathy retina. (A) Characteristic ACE2 expression in retina specimens from nondiabetic retina, NPDR, and PDR. Black arrows denote retinal capillaries, with significantly increased staining in diabetes. (B) ACE2 positive vessel staining was quantitated in retinas from nondiabetic retina, NPDR, and PDR. (C) Characteristic ACE2 expression in renal specimens from nondiabetic and diabetic nephropathy. ACE2 staining was absent in peritubular capillaries (yellow arrowhead) and glomerular capillary loop (red arrow). (D) Isotype IgG control was negative for staining.
ACE2在非糖尿病和糖尿病腎臟中的表達(dá)
糖尿病腎病是另一種眾所周知的糖尿病微血管并發(fā)癥。我們進(jìn)一步研究了腎臟標(biāo)本中 ACE2的表達(dá)，包括血管 ACE2的表達(dá)。與以前的報(bào)道一致，在非糖尿病腎臟標(biāo)本的腎小管上皮細(xì)胞中觀察到31個(gè) ACE2的表達(dá)。在糖尿病腎臟中，我們觀察到與非糖尿病腎臟標(biāo)本相似的 ACE2表達(dá)模式(圖2C)。有趣的是，在非糖尿病和糖尿病腎臟中都沒有觀察到血管 ACE2的表達(dá)(圖2C)。
ACE2在 PDR 中的視網(wǎng)膜血管表達(dá)
我們進(jìn)一步評(píng)估了哪些血管細(xì)胞類型表達(dá) ACE2。通過免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn) ACE2與內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物 CD31共定位。如圖3A 所示，我們觀察到毛細(xì)血管橫切面和縱切面 ACE2和 CD31雙陽(yáng)性染色。我們還在 CD31陰性細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了 ACE2染色，這在形態(tài)學(xué)上可以指示 NFL 中的周細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞。在免疫組織化學(xué)染色的高倍圖像中，我們還發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中 ACE2的表達(dá)(圖3B)。
ACE2 expression in vessels (A) ACE2 is colocalized with some CD31-positive endothelial cells in retina. White arrows show ACE2 positive capillaries in cross section. Blue arrows mark longitudinal cuts through a capillary with endothelial cells positive for both CD31 and ACE2; ACE2 expression in perivascular cells (yellow arrowhead); (B) Upper panel: ACE2 expression in a small capillary endothelial cell (arrow), with a larger caliber vessel above lined by ACE2-negative endothelial cells. Lower panel: ACE2 expression in a small capillary endothelial cell (arrow) in a hyalinized vessel.
原代人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞中 ACE2蛋白的表達(dá)
為了進(jìn)一步證實(shí) ACE2在人視網(wǎng)膜血管細(xì)胞中的表達(dá)，我們通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)了 ACE2在原代 HREC 和原代人周細(xì)胞中的表達(dá)。如圖4所示，ACE2蛋白在 HREC 和原代人周細(xì)胞中均有表達(dá)。
ACE2 expression in primary human retina endothelial cells and primary human pericytes. Western blot analysis demonstrated ACE2 protein expression in both primary human retina endothelial cells and primary human pericytes.
TMPRSS2在人視網(wǎng)膜中的表達(dá)
我們進(jìn)一步研究了 TMPRSS2的表達(dá)，這是一種重要的細(xì)胞表面相關(guān)蛋白酶，允許病毒進(jìn)入。如圖5a 所示，在神經(jīng)纖維層、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外叢狀層和外核層的一些細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 TMPRSS2的表達(dá)。TMPRSS2在血管/血管周細(xì)胞和徑向突起中表達(dá)，與 Müller 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)一致。同種型 IgG 對(duì)照對(duì) TMPRSS2染色呈陰性(圖5B)。
TMPRSS2 expression in human retina. (A) Characteristic TMPRSS2 expression in retina specimens from nondiabetic retina. TMPRSS2 expression was found in some cells in the nerve fiber layer, retinal ganglion cell layer, inner nuclear layer, outer plexiform layer, and outer nuclear layer. TMPRSS2 is expressed in vascular/perivascular cells (black arrow) and radial processes morphologically consistent with Müller glia (red arrows). (B) Isotype IgG control was negative for staining.
討論
越來越多的臨床研究報(bào)道了2019冠狀病毒疾病患者的視網(wǎng)膜異常，但是視網(wǎng)膜是否會(huì)感染 SARS 冠狀病毒還不得而知。值得注意的是，ACE2的表達(dá)，關(guān)鍵的 SARS-CoV-2受體，在人類視網(wǎng)膜以前沒有報(bào)道。在這里，我們報(bào)告了人類神經(jīng)視網(wǎng)膜中多種細(xì)胞類型的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的表達(dá)，以及糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的顯著上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)2019冠狀病毒疾病和糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜表現(xiàn)有潛在的影響。
血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的存在支持了視網(wǎng)膜對(duì) SARS-CoV-2感染的潛在易感性，在全身感染的情況下作為視網(wǎng)膜侵襲的入口。除了直接感染視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞外，這種表達(dá)還可以作為神經(jīng)視網(wǎng)膜感染和損傷的手段，特別是伴隨 TMPRSS2的細(xì)胞表達(dá)。值得注意的是，在大腦中，脈絡(luò)叢細(xì)胞和腦內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) ACE2被認(rèn)為是血腦屏障浸潤(rùn)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì) SARS-CoV-2感染的易感性的基礎(chǔ)[28,32]。此外，結(jié)合 ACE2的 SARC-CoV-2穗蛋白損害腦內(nèi)皮細(xì)胞并損害 EC 屏障完整性，32對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和血視網(wǎng)膜屏障完整性具有影響。
盡管我們的研究結(jié)果表明視網(wǎng)膜對(duì) SARS-CoV-2感染的易感性，但是認(rèn)識(shí)到其他的考慮因素是很重要的。可以想象，許多2019冠狀病毒疾病的視網(wǎng)膜表現(xiàn)，包括視網(wǎng)膜出血和棉花斑，可能是系統(tǒng)性炎癥和凝血功能障礙的結(jié)果，而不是視網(wǎng)膜細(xì)胞的直接病毒感染。此外，到目前為止，與其他器官相比，視網(wǎng)膜2019冠狀病毒疾病受累的病人報(bào)告較少。雖然這可能部分反映了這些患者相對(duì)缺乏眼科檢查，但視網(wǎng)膜表現(xiàn)頻率較低可能是由于其他重要因素，包括視網(wǎng)膜病毒載量較低或病毒清除的局部因素。
作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，ACE2是公認(rèn)的心血管疾病的保護(hù)因子。具體來說，血管緊張素2是血管緊張素/血管緊張素 II/血管緊張素1型受體軸的負(fù)調(diào)節(jié)因子，是糖尿病并發(fā)癥的 RAS 的致病因子。11關(guān)于糖尿病視網(wǎng)膜病變，實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明在糖尿病小鼠中具有腸屏障功能與血管緊張素2缺乏，對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能具有假定的致病性影響。34糖尿病小鼠中的血管緊張素2缺乏也損害骨髓功能，影響保護(hù)性造血干細(xì)胞，并加劇視網(wǎng)膜毛細(xì)血管變性。因此，增加的視網(wǎng)膜血管。我們的研究進(jìn)一步支持糖尿病中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的表達(dá)可能是一把雙刃劍的觀點(diǎn)。11盡管糖尿病中ACE2的表達(dá)可能是對(duì)抗糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)機(jī)制，但它可能會(huì)增強(qiáng)與2019冠狀病毒疾病相關(guān)的視網(wǎng)膜損傷，這在以前的研究中已有報(bào)道。這與糖尿病作為2019冠狀病毒疾病重要并發(fā)癥的一般認(rèn)識(shí)是一致的。
未來的研究對(duì)于闡明2019冠狀病毒疾病對(duì)非糖尿病和糖尿病人群的視網(wǎng)膜影響至關(guān)重要，以及這是否直接由于病毒感染或繼發(fā)于炎癥損傷，類似于已被更廣泛描述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累。
參考
Zhou L, Xu Z, Guerra J, Rosenberg AZ, Fenaroli P, Eberhart CG, Duh EJ. Expression of the SARS-CoV-2 Receptor ACE2 in Human Retina and Diabetes-Implications for Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021 Jun 1;62(7):6. doi: 10.1167/iovs.62.7.6IF: 4.925?Q1?. PMID: 34086044; PMCID: PMC8185397.
