心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)又稱循環(huán)系統(tǒng)疾病，主要包括心臟病和心臟的血管病兩大類，其中臨床表現(xiàn)為高血壓、心絞痛、冠心病、心律失常和急性心肌梗死等。

調(diào)查數(shù)據(jù)顯示2019 年間大約 1,790 萬人死于心血管疾病，占全球死亡總數(shù)的32％，已經(jīng)成為全球第一殺手[1]，且患病人數(shù)不斷持續(xù)增加。

隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因治療作為一種新興的療法在心臟疾病中展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力，尤其是腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）具有安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣、免疫源性低、在體內(nèi)能長時間表達(dá)外源基因等特點，被廣泛用于基因治療的遞送載體。

此外，AAV具有不同的血清型和啟動子，針對不同的組織器官選擇合適的血清型搭配特異性啟動子，可進(jìn)行靶向高效感染。今天小恒就和大家一起來學(xué)習(xí)一下AAV在心臟疾病研究中的優(yōu)化策略。

1、AAV血清型的選擇

不同的AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)，識別不同的細(xì)胞表面受體，表現(xiàn)為不同的組織親嗜性。AAV1、AAV2、AAV6、AAV8和AAV9型等均被報道對心臟有較好的感染效率，目前靶向心肌使用最為廣泛的是AAV9血清型。用不同血清型通過頸靜脈注射感染一周齡小鼠，四周后通過活體成像和冰凍切片觀察心肌感染情況，結(jié)果顯示，AAV8和AAV9對心臟的感染效率均高于其他血清型，并且AAV9的擴散性高于AAV8。

圖1 活體成像觀察五種不同血清型感染小鼠心臟效率[2]

圖2 冰凍切片觀察五種不同血清型感染小鼠心臟效率[2]

2、啟動子的選擇

心臟由心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞組成，非心肌細(xì)胞占總數(shù)的70%，其中90%以上的非心肌細(xì)胞由心肌成纖維細(xì)胞組成。高效靶向心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞對于心臟相關(guān)疾病的研究尤為重要。漢恒可提供cTNT、POSTN、COL2A1、TCF21四種靶向心臟的特異性啟動子。

將帶有CMV和cTNT的AAV病毒通過頸靜脈注射感染一周齡小鼠，四周后通過活體成像觀察心臟感染情況，結(jié)果顯示，cTNT在心臟表達(dá)的特異性更強。

圖3 CMV和cTNT在心臟表達(dá)的特異性比較[2]

此外，將帶有EF1a和cTNT的AAV病毒通過心肌內(nèi)注射感染8-10周齡小鼠，60天后通過冰凍切片觀察感染效率，結(jié)果顯示，cTNT在心臟中表達(dá)效果更好。

圖4 EF1a和cTNT在心臟表達(dá)的特異性比較[3]

15周小鼠心梗造模2天后，將AAV-periostin(POSTN)-GFP病毒通過尾靜脈注射體內(nèi)，3周后取心臟組織觀察熒光，結(jié)果顯示GFP在活化的心肌成纖維細(xì)胞種表達(dá)。

圖5 periostin(POSTN)-GFP在心臟中表達(dá)觀察[4]

AAV-hTCF21-GFP病毒通過靜脈注射4月齡小鼠，免疫熒光結(jié)果顯示GFP在心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)。

圖6 hTCF21-GFP在心臟成纖維中表達(dá)觀察[5]

3、注射方式和注射劑量

AAV靶向心臟的遞送方式主要包括系統(tǒng)性注射、原位注射和冠脈注射等，目前文獻(xiàn)報道較多的是原位注射（心肌原位注射）和系統(tǒng)性注射（尾靜脈注射）。

4、應(yīng)用案例

案例一：

文章標(biāo)題：CB1R-stabilized NLRP3 inflammasome drives antipsychotics cardiotoxicity

雜志：Signal Transduction and Targeted Therapy

IF：38

病毒工具：AAV9-EGFP和AAV9-CB1R

注射方式：原位注射心臟左心室3-5個位點，2×10^11 vg/小鼠

檢測時間：6周

圖7 AAV9原位注射感染心臟[6]

案例二：

文章標(biāo)題：SUMO1 regulates post-infarct cardiac repair based on cellular heterogeneity

雜志：Journal of Pharmaceutical Analysis

IF：14

病毒工具：AAV9-CTnT-SUMO1-EGFP

注射方式：尾靜脈注射，1×10^11 vg/小鼠，100 μl

檢測時間：3周

圖8 AAV9-CTnT尾靜脈注射感染心臟[7]

案例三：

文章標(biāo)題：N-glycosylation-mediated CD147 accumulation induces cardiac fibrosis in the diabetic heart through ALK5 activation

雜志：International Journal of Biological Sciences

IF：10

病毒工具：AAV9-cTNT-m-CD147和AAV9-cTNT-m-null

注射方式：心肌原位注射，1×10^11 vg/小鼠

檢測時間：4周

圖9 AAV9-CTnT原位注射感染心臟[8]

參考文獻(xiàn)

[1] World Health Statistics 2021,https://www.who.int/publications/i/item/9789240027053

[2] Prasad KM, Xu Y, Yang Z, Acton ST, French BA. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Ther. 2011 Jan;18(1):43-52. doi: 10.1038/gt.2010.105. Epub 2010 Aug 12. PMID: 20703310; PMCID: PMC2988989.

[3] García-Olloqui P, Rodriguez-Madoz JR, Di Scala M, Abizanda G, Vales á, Olagüe C, Iglesias-García O, Larequi E, Aguado-Alvaro LP, Ruiz-Villalba A, Prosper F, Gonzalez-Aseguinolaza G, Pelacho B. Effect of heart ischemia and administration route on biodistribution and transduction efficiency of AAV9 vectors. J Tissue Eng Regen Med. 2020 Jan;14(1):123-134. doi: 10.1002/term.2974. Epub 2019 Dec 22. PMID: 31677236.

[4] Piras BA, Tian Y, Xu Y, Thomas NA, O'Connor DM, French BA. Systemic injection of AAV9 carrying a periostin promoter targets gene expression to a myofibroblast-like lineage in mouse hearts after reperfused myocardial infarction. Gene Ther. 2016 May;23(5):469-78. doi: 10.1038/gt.2016.20. Epub 2016 Feb 29. PMID: 26926804.

[5] Francisco J, Zhang Y, Nakada Y, Jeong JI, Huang CY, Ivessa A, Oka S, Babu GJ, Del Re DP. AAV-mediated YAP expression in cardiac fibroblasts promotes inflammation and increases fibrosis. Sci Rep. 2021 May 18;11(1):10553. doi: 10.1038/s41598-021-89989-5. PMID: 34006931; PMCID: PMC8131354.

[6] Li L, Gao P, Tang X, Liu Z, Cao M, Luo R, Li X, Wang J, Lin X, Peng C, Li Z, Zhang J, Zhang X, Cao Z, Zou Y, Jin L. CB1R-stabilized NLRP3 inflammasome drives antipsychotics cardiotoxicity. Signal Transduct Target Ther. 2022 Jun 24;7(1):190. doi: 10.1038/s41392-022-01018-7. PMID: 35739093; PMCID: PMC9225989.

[7] Liu Z, Liu X, Liu L, Wang Y, Zheng J, Li L, Li S, Zhang H, Ni J, Ma C, Gao X, Bian X, Fan G. SUMO1 regulates post-infarct cardiac repair based on cellular heterogeneity. J Pharm Anal. 2023 Feb;13(2):170-186. doi: 10.1016/j.jpha.2022.11.010. Epub 2022 Dec 5. PMID: 36908856; PMCID: PMC9999303.

[8] Liu M, Peng T, Hu L, Wang M, Guo D, Qi B, Ren G, Wang D, Li Y, Song L, Hu J, Li Y. N-glycosylation-mediated CD147 accumulation induces cardiac fibrosis in the diabetic heart through ALK5 activation. Int J Biol Sci. 2023 Jan 1;19(1):137-155. doi: 10.7150/ijbs.77469. PMID: 36594096; PMCID: PMC9760447.

除本文用到的心臟特異性啟動子AAV病毒外，漢恒生物還研發(fā)了靶向神經(jīng)、肌肉、肺、肝臟、視網(wǎng)膜等組織器官的特異性啟動子AAV病毒；此外，根據(jù)衣殼蛋白結(jié)構(gòu)不同，漢恒還研發(fā)了幾十種靶向性各異的血清型病毒。合適的血清型搭配特異性啟動子，可針對不同的組織器官進(jìn)行靶向高效感染。