CRISPR/Cas9技術(shù)簡述

簡單來講，CRISPR/Cas9是一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過這種技術(shù)科研人員可以對細(xì)胞和生物體內(nèi)的基因進(jìn)行編輯。所謂的基因編輯就是通過某種生物手段和技術(shù)，對生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修改。

基于原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)研發(fā)出的CRISPR/Cas9技術(shù)只包含兩種重要的成分，一種是行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白，而另一種則是具有導(dǎo)向功能的sgRNA（single guide RNA）。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá)sgRNA和Cas9蛋白時，Cas9蛋白通過與sgRNA結(jié)合，靶向到目的DNA序列上發(fā)揮DNA雙鏈切割的功能。DNA序列被切割產(chǎn)生斷裂后，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)部的DNA修復(fù)機制（DNA repair）。真核細(xì)胞同時存在著同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù)。在同源重組修復(fù)下，斷裂的染色體以另一條完整的姐妹染色單體為模板進(jìn)行DNA修復(fù)，而在非同源重組修復(fù)下，斷裂出的DNA隨機修復(fù)，引入新的堿基，使基因產(chǎn)生移碼突變。

CRISPR/Cas9技術(shù)原理

CRISPR/Cas9的基因敲除

CRISPR/Cas9其中一種最為重要且廣泛的應(yīng)用便是基因敲除。

從很久以前，生物學(xué)家們就熱衷于一種研究策略，那就是功能缺失策略（loss of function）。常規(guī)的理解是這樣的，當(dāng)我們想要去研究某個基因在整個基因組中的作用時，只需要通過某種方法將這個基因從基因組中剔除，然后觀察去除這個基因之后，這個細(xì)胞或生物體會發(fā)生怎樣的變化，然后根據(jù)這些變化去推斷這個基因的功能?；蚯贸褪怯脕砻枋鰧⒛硞€或某些基因從基因組中剔除這件事，而基因敲除技術(shù)則是用于完成這件事的方法或技術(shù)。

那又該如何實現(xiàn)基因敲除呢？

在實際實驗過程中，我們只需要將Cas9蛋白和設(shè)計好的gRNA同時“運送”進(jìn)細(xì)胞中即可，接下來的就交給細(xì)胞自己去操作了。

對于轉(zhuǎn)導(dǎo)gRNA和Cas蛋白的常見方法主要有四種：

(1）RNP法：直接將大量的gRNA和Cas9蛋白，通過電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞

(2）病毒法：構(gòu)建慢病毒（LV）敲除質(zhì)粒，經(jīng)病毒包裝和純化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將sgRNA和Cas9蛋白元件整合到細(xì)胞基因組中，從而使細(xì)胞源源不斷地生產(chǎn)sgRNA和Cas9蛋白。

(3）常規(guī)質(zhì)粒法：構(gòu)建常規(guī)敲除質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)將其導(dǎo)入細(xì)胞，短時間內(nèi)表達(dá)gRNA和Cas9蛋白。

(4）VIRUS-Free?轉(zhuǎn)座子法：將攜帶有轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)座酶促進(jìn)轉(zhuǎn)座，將高拷貝的Cas9蛋白和gRNA表達(dá)元件隨機整合到基因組，實現(xiàn)gRNA和Cas9蛋白的持續(xù)表達(dá)。

4種基因敲除的技術(shù)對比

總的來說，蛋白法不需要構(gòu)建載體，最快捷，但是sgRNA容易降解，操作難度大，一般更多應(yīng)用于點突變和定點插入；常規(guī)瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒法構(gòu)建簡單，但是效率低；病毒法效率高，但是周期長，成本更高；Virus-Free穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒法穩(wěn)定整合而不需要包病毒，效率高周期短，是一種很好的替代病毒的方法。

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