編者按

在不斷發(fā)展的基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域，靶向治療藥物的開發(fā)依賴于結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)量和分辨率。針對(duì)Tau蛋白的藥物開發(fā)同樣離不開高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)信息。Tau蛋白的不當(dāng)折疊導(dǎo)致會(huì)導(dǎo)致20多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并被統(tǒng)稱為tauopathies。目前的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究試圖弄清錯(cuò)誤折疊的tau蛋白是如何聚集的，并開發(fā)出有效的治療方法來(lái)破壞這一過(guò)程從而阻止相關(guān)疾病的發(fā)生。近日發(fā)表的一篇eLife文章中，研究人員使用冷凍電鏡來(lái)測(cè)試體外tau聚集的廣泛條件，確定了76個(gè)不連續(xù)的tau蛋白絲結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)中的27個(gè)是全新的，擴(kuò)大了我們對(duì)tau組裝的基礎(chǔ)性理解。同時(shí)還成功成像了在阿爾茨海默病患者腦部中聚集的淀粉樣蛋白-β組成的蛋白纖維。對(duì)體外纖維素的清晰表征可以為這些疾病開發(fā)出更好的體外模型和抑制組裝的治療藥物。

"Cryo-EM Research Is Changing the Way We Look at Neurodegenerative Diseases"

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Tau蛋白在神經(jīng)元微管的組裝和結(jié)構(gòu)中起著關(guān)鍵作用。Tau蛋白的不當(dāng)折疊導(dǎo)致蛋白質(zhì)異常地積累成高度結(jié)構(gòu)化的細(xì)絲"纖維"，并聚集成顯微鏡下可見的"團(tuán)狀物"。包括阿爾茨海默癥在內(nèi)的20多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的特點(diǎn)是Tau蛋白的功能障礙，并被統(tǒng)稱為tauopathies。這些疾病中的大多數(shù)都與tau基因的突變有關(guān)。

雖然tauopathies很容易通過(guò)腦細(xì)胞中產(chǎn)生纖維團(tuán)狀物后被識(shí)別出來(lái)，但目前的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究試圖在分子尺度上弄清單個(gè)絲狀物形成的原因。最終的目標(biāo)是清楚地了解錯(cuò)誤折疊的tau蛋白是如何聚集的，并開發(fā)出有效的治療方法來(lái)破壞這一過(guò)程從而阻止相關(guān)疾病的發(fā)生。冷凍電鏡已經(jīng)成為tau蛋白細(xì)絲結(jié)構(gòu)分析的一個(gè)重要工具，因?yàn)槔鋬鲭婄R單顆粒技術(shù)可以揭示蛋白細(xì)絲聚集過(guò)程的近原子分辨率的細(xì)節(jié)。冷凍電鏡已經(jīng)被用來(lái)解決幾種tauopathies有關(guān)的結(jié)構(gòu)，包括阿爾茨海默氏病、慢性創(chuàng)傷性腦病、皮克氏病和皮質(zhì)-基質(zhì)變性。

Tau蛋白絲的結(jié)構(gòu)解析

在不斷發(fā)展的基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域，靶向治療藥物的開發(fā)自身依賴于結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)量和分辨率。Tauopathies也不例外，有效的治療方法可能需要清楚地了解從最初的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊一直到最后的纖維纏結(jié)的形成的整個(gè)過(guò)程。值得注意的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的tauopathies具有不同的tau折疊特征。目前，人們正在努力對(duì)tauopathies進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的分類，提供一個(gè)基于細(xì)絲折疊的層次組織。通過(guò)了解tauopathies的關(guān)系，研究人員可以解開疾病進(jìn)展的具體細(xì)節(jié)，并最終開發(fā)出高度具體的、有針對(duì)性的治療方法。

利用冷凍電鏡

推進(jìn)tauopathy的研究

研究tau的聚集需要對(duì)組裝過(guò)程中的中間物進(jìn)行控制檢查。由于這些觀察不能總是在體內(nèi)進(jìn)行，蛋白質(zhì)片段經(jīng)常被用作蛋白質(zhì)聚集的體外模型系統(tǒng)。組裝表征能夠反映體內(nèi)結(jié)構(gòu)的tau蛋白絲，將是更清楚地了解纖維素形成及其在疾病中的作用的一個(gè)關(guān)鍵步驟。冷凍電鏡非常適合研究這些瞬時(shí)結(jié)構(gòu)，因?yàn)橐坏┻_(dá)到所需的組裝水平，樣品就會(huì)被冷凍，基本上就可以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)檢查 "快照"的方式得到瞬時(shí)結(jié)構(gòu)。

直到最近，研究人員一直無(wú)法復(fù)制在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的確切的tau結(jié)構(gòu)，因?yàn)轶w外的緩沖條件往往不能模仿細(xì)胞環(huán)境，而且片段并不總是遵循與全長(zhǎng)蛋白相同的聚集途徑。這不僅導(dǎo)致了不同的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，甚至出現(xiàn)了具有相同成分但結(jié)構(gòu)明顯不同的原絲（超微結(jié)構(gòu)多態(tài)性）。因此通常需要進(jìn)行分子尺度的分類來(lái)區(qū)分這些聚合體，但這可能很耗時(shí)，而且許多技術(shù)要求樣品只包含單一結(jié)構(gòu)。通過(guò)冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，不僅可以區(qū)分不同的樣品，甚至在同一溶液中也可以區(qū)分多種多態(tài)性，因?yàn)樵跀?shù)據(jù)處理過(guò)程中可以對(duì)結(jié)構(gòu)相似的類別進(jìn)行分組。

Tau絲的XY中心切片顯示了Tau蛋白在絲中的單層。一條絲由數(shù)千層相互堆疊而成。圖片由英國(guó)劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Sofia L?vestam提供。

在最近發(fā)表的一篇eLife文章中，研究人員使用高通量冷凍電鏡工作流程來(lái)測(cè)試體外tau聚集的廣泛條件。他們能夠確定76個(gè)不連續(xù)的tau絲結(jié)構(gòu)，包括幾個(gè)疾病中發(fā)現(xiàn)的tau蛋白絲的體內(nèi)構(gòu)象。這些結(jié)構(gòu)中的27個(gè)是全新的，擴(kuò)大了我們對(duì)tau組裝的基礎(chǔ)性理解。

在對(duì)樣品制備條件的調(diào)查中，他們注意到tau的聚集高度依賴于溶液中的陽(yáng)離子。雖然鎂和鈣離子導(dǎo)致了阿爾茨海默病中發(fā)現(xiàn)的成對(duì)螺旋蛋白絲的形成，但鈉導(dǎo)致了與慢性創(chuàng)傷性腦病中所見的tau折疊。這加強(qiáng)了離子條件在Tau集合體的聚集傾向和最終結(jié)構(gòu)中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。

雖然這項(xiàng)tau研究的重點(diǎn)是將體外組裝與體內(nèi)結(jié)構(gòu)相聯(lián)系，但也有人直接分析從阿爾茨海默病患者捐贈(zèng)的腦組織（體外）提取的蛋白絲。冷凍電鏡成功成像了由淀粉樣蛋白-β組成的蛋白纖維，這種蛋白質(zhì)也被發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病患者腦部中聚集。對(duì)體外纖維素的清晰表征可以為這些疾病開發(fā)出更好的體外模型和抑制組裝的治療藥物。

值得注意的是，這種高通量的結(jié)構(gòu)表征只有在冷凍電鏡技術(shù)和工作流程的革新下才有可能。最初的篩選是在較低的分辨率下進(jìn)行的，通過(guò)軟件指導(dǎo)加速確定冷凍樣品的最佳區(qū)域，以便在更高分辨率的儀器上進(jìn)一步成像。隨后的數(shù)據(jù)分析也因軟件自動(dòng)化而大大加快，該軟件無(wú)需研究人員的手動(dòng)輸入就能完成大部分的圖像處理。

Tauopathy治療方法的未來(lái)

盡管我們對(duì)tauopathies的了解越來(lái)越多，但仍然沒(méi)有認(rèn)可的治療方法來(lái)阻止這些疾病的發(fā)展。上述研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞環(huán)境在tau和其他淀粉樣蛋白的聚集傾向和結(jié)構(gòu)中可能發(fā)揮的巨大作用。現(xiàn)在迫切需要結(jié)構(gòu)信息，不僅僅是體外的，最好是在細(xì)胞環(huán)境中的結(jié)構(gòu)信息，以指導(dǎo)開發(fā)有針對(duì)性的治療方法，以阻止特定的蛋白質(zhì)相互作用。

冷凍電鏡非常適合提供這種關(guān)鍵信息，特別是隨著互補(bǔ)性的冷凍電子顯微鏡技術(shù)的相互聯(lián)系日益緊密，如單顆粒分析和冷凍層析技術(shù)。自動(dòng)化的工作流程給研究人員提供了一個(gè)明確和可靠的方法來(lái)生成曾經(jīng)需要幾周甚至幾個(gè)月才能獲得的結(jié)構(gòu)。通過(guò)降低數(shù)據(jù)收集的門檻，研究人員可以專注于優(yōu)化更精確地代表體內(nèi)信息的實(shí)驗(yàn)條件，并最終在分子尺度看到潛在的治療藥物的方案。這種水平的信息有望革新我們對(duì)神經(jīng)衰退性疾病的理解，以及我們發(fā)現(xiàn)和測(cè)試這些衰弱性疾病的潛在治療方法的速度。

水木未來(lái)丨視界iss.35Credit@Technology Networks

"Cryo-EM Research Is Changing the Way We Look at Neurodegenerative Diseases"